冯建萍,王 梅,李存香,张爱萍,赵海红,金 星,李广辉
(青海省地方病预防控制所,青海 西宁 810021)
鼠疫是自然疫源性疾病,具有传播快、病死率高的特点。青海省有两处鼠疫自然疫源地,即喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地和青海田鼠鼠疫自然疫源地[1],其主要宿主为细菌学判定的偶蹄类染疫动物喜马拉雅旱獭、藏系绵羊等[2]。关于鼠疫宿主的判定、新疫源地的发现、鼠疫疫源性的分析研究,都需要通过鼠疫病原菌的分离鉴定才能做出正确诊断[3]。因此,作为鼠疫菌生长“温床”的培养基就显得尤为重要,在鼠疫细菌检验中发挥着重要作用。鼠疫菌虽然在普通培养基上能够生长发育,但只有在一般含有鼠疫菌的新鲜材料上才能获得满意的结果。为使鼠疫菌能良好发育,实验室目前以添加脱纤维兔溶血为主要培养基[4]。本试验以喜马拉雅旱獭血液、绵羊血液、布氏菌专用血培养、脱纤维兔溶血为刺激剂制成敏感培养基,评价其用于鼠疫菌的生长效果,为今后鼠疫敏感培养基筛选、鼠疫现场应用和鼠疫病原学研究提供科学依据。
1.1材料 鼠疫(EV76-Paris)株,由国家鼠疫菌专业实验保藏中心提供;脱纤维藏系绵羊血液,购自源叶生物公司;喜马拉雅旱獭全血,采集自青海省海南藏族自治州同德县河北乡;脱纤维兔溶血,由青海省地方病预防控制所培养基室提供;布氏菌专用血,购自青岛中创汇科生物科技有限公司;磷酸氢二钠,购自天津市凯通化学试剂有限公司;氯化钠,购自天津市登科化学试剂有限公司;进口蛋白胨、琼脂粉购自北京欣经科生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1培养基基础液制备 称取去筋膜、无脂肪碎牛肉1 000 g,放入1 500 mL水中,煮沸30 min,待冷却至56℃时加入无水碳酸钠15 g、胰蛋白酶5 g,用1 mol/L氢氧化钠矫正PH为7.8,加入三氯甲烷15 mL,置37℃振荡温箱7～9 d[5,6]。
1.2.2基础液氨基氮含量测定 用1 mol/L氢氧化钠滴定1.4 mg的公式计算,结果乘以100即为100 mL培养基内所含氨基氮的毫克数[7]。
1.2.3培养基添加剂选择 选取4种不同添加剂,即兔溶血液、绵羊血液、喜马拉雅旱獭血液和布氏菌专用血培养,将其添加到普通培养基中制成赫氏敏感培养基[8]。
1.2.4培养基制备 按常规法制成基础培养基[8]。共制作5 000 mL,其中1 000 mL普通培基作为对照组,其余4 000 mL,每1 000 mL分别加入兔溶血液、绵羊血液、喜马拉雅旱獭血液和布氏菌专用血各10 mL,混匀倾注平皿,放入37℃温箱24 h无菌生长后方可使用[9]。
1.2.5活菌数测定 取EV7628℃ 24 h培养物,按常规稀释方法进行稀释,使鼠疫菌悬液最终浓度为1 000个菌/mL,分别接种鼠疫菌悬液0.1 mL放置于制备好的5种培养基平皿中,并用L棒涂抹均匀,28℃培养48 h后计算菌落数[10]。
2.1不同敏感培养基对鼠疫菌生长的影响 为进一步明确5种培养基对鼠疫菌的不同刺激作用,经计算得出秩和平均值分别为56.90、74.91、128.82、64.91、111.11,其中3组和5组培养基的秩和平均值明显大于其他三组培养基,说明,绵羊血液和喜马拉雅旱獭血液培养基对鼠疫菌的生长所起的作用优于普通赫氏培养基、兔溶血液培养基和布氏菌专用血制作的培养基(见表1)。
表1 不同敏感培养基对鼠疫菌生长的作用
2.2不同敏感培养基鼠疫菌生长情况的统计学分析
几种敏感培养基对鼠疫菌的生长情况经统计学分析,差异有明显的统计学意义(F=53.681,P=0.000,P<0.05)。由此说明,绵羊血液培养基和喜马拉雅旱獭血液培养基对鼠疫菌的生长作用优于其他三组培养基,即对鼠疫菌生长有明显的促进作用,是比较理想的添加剂(见表2)。
表2 不同敏感培养基对鼠疫菌生长情况的统计学分析
鼠疫是典型的自然疫源性疾病,从生态学角度来看,鼠疫菌、宿主和媒介之间具有特殊的寄生链关系,既互相依存,又相互制约。鼠疫病原体的宿主是维持鼠疫自然疫源地的稳定因素和基本条件[11],分离到鼠疫菌是鼠疫判定的依据之一,它的生长发育需要多种营养和生长调节物质,当其缺乏时,生长发育将受阻。鼠疫菌在繁殖过程中,其生长发育所需的营养和生长因子主要依靠培养基供给[12]。培养基是鼠疫菌生长的温床,是鼠疫菌分离营养的基础介质,也是检验的重要环节之一[13]。若从含菌量稀少的材料,特别是腐败材料中单独依靠普通琼脂培养基是非常困难的,必须采用优质培养基[14]。为使鼠疫菌更好地生长和繁殖,在基础培养基制备过程中通常加入刺激鼠疫菌生长的因子[15]。有学者研究认为,血液是鼠疫菌生长的最好刺激剂,它的原理在于降低培养基内的氧压,利于鼠疫菌的发育。血液中的血红素还能刺激鼠疫菌的呼吸,缩短其迟致期限[16]。实验室一般习惯用家兔溶血,且以脱纤维兔溶血更佳。其它血液对鼠疫菌的生长作用效果如何,目前尚无报道。本研究将用绵羊血液、喜马拉雅旱獭血液、兔溶血液和布氏菌专用血分别添加到普通培养基中制成敏感培养基,通过活菌计数观察鼠疫菌的生长情况。经统计学秩和检验分析,P<0.05的差异有统计学意义。由此说明,绵羊血液培养基和喜马拉雅旱獭血液培养基对鼠疫菌的生长作用优于兔溶血培养基、布氏菌专用血培养基和普通赫氏培养基,是比较理想的添加剂。通常情况下,鼠疫菌敏感培养基常采用脱纤维兔溶血,但绵羊血液和喜马拉雅旱獭血液对鼠疫菌的生长刺激作用如何,之前从未进行过试验。本研究通过活菌计数统计学分析发现,绵羊血液和喜马拉雅旱獭血液也是比较理想的鼠疫敏感培养基添加剂。
喜马拉雅旱獭是松鼠科啮齿类动物,是一种比较凶猛的野生动物,具有一定的攻击性,捕获难度很大,造成实验动物数量不足且采血困难。尽管旱獭血液对鼠疫菌的生长具有良好的作用,但在日常实验室培养基制备时不适用。藏系绵羊隶属偶蹄牛科盘羊属动物,广泛分布于青藏高原鼠疫自然疫源地内,宜采血,对腐败及含菌量稀少的材料适用性较佳。家兔作为实验动物模型在实验室普遍使用,它的血液作为敏感培养基的刺激剂适用性很强。因此,脱纤维绵羊血和兔溶血均可以作为鼠疫菌生长的理想刺激剂[17]。
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