谢 喆，孙云鹏*，金文芳，刘劲松，王国凯,2*
（1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；
2.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012）
向天果（FructusSwieteniamacrophylla）为大叶桃花心木（Swieteniamacrophylla）的果实[1]，主要分布在热带及亚热带地区。果实味苦、涩，具有收敛、解热等功效，种子主要可用于治疗高血糖、高血压等疾病[2-3]。前期研究表明，向天果中富含柠檬苦素类成分[4-5]。此类化合物不仅结构多样[6]，还具有抗氧化[7]、抗肿瘤[8]和抗病毒[9]等生物活性。
目前向天果作为保健品在市场上流通，并无统一的质量标准，不同来源的向天果之间是否存在成分或品质差异是亟待解决的问题。中药指纹图谱能体现中药质量控制的系统性和整体性，被认为是中药质量控制的有效手段[10-11]。本研究通过建立不同来源的向天果指纹图谱，并进行含量测定，结合聚类分析[12]，了解各批次向天果之间品质的差异，为向天果的质量控制提供依据。
1.1 仪器
Waters 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；
KQ3200DB型数控超声清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；
BP211D型电子天平（德国Sartorius）。
1.2 材料
甲醇，乙腈（色谱纯，Sigma公司）；
磷酸为分析纯；
蒸馏水（双蒸水）；
对照品3,6-O,O-diacetylswietenolide，swietenolide，swietenine，swietemahonin F，3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide均由安徽中医药大学药物化学实验室从大叶桃花心木中分离得到，经薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）确认其性质与纯度，纯度均在95 %以上。
向天果样品（批号：S1～S30）通过电商平台购得，由安徽中医药大学药学院方成武教授鉴定为楝科植物大叶桃花心木（Swieteniamacrophylla）的果实，商家标示的药材产地见表1。
表1 30批向天果样品批号及产地
2.1 色谱条件
色谱柱：KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱（0～15 min，45 %～48 %A；
15～35 min，48 %～51 %A；
35～36 min,51 %～55 %A；
36～47 min，55 %～100 %A；
47～54 min，100 %A；
54～55 min，100 %～45 %A）；
流速1.0 ml/min；
柱温：30 ℃；
检测波长210 nm；
进样量20 μl。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取5种柠檬苦素类化合物适量，加入适量甲醇溶解，定容，摇匀，配制成一定浓度的对照品溶液，备用。
2.3 供试品溶液的制备
精密称定各批次向天果粗粉0.5 g，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml超声提取30 min，冷却后定容，静置，取上清，过微孔滤膜（0.22 μm），备用。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取样品S1，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，所得色谱图输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”中进行相似度分析，结果显示相似度均在0.98以上，且13个共有峰的保留时间RSD值均小于0.16 %，符合指纹图谱要求。
2.4.2 稳定性试验 取样品S1，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别放置0，4，8，12，16，24 h后进样，所得色谱图进行相似度分析，结果显示色谱图相似度均在0.94以上，且13个共有峰的保留时间RSD值均小于0.16 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.3 重复性试验 取样品S3，按2.3项下方法制备供试品溶液6份，依次进样，所得色谱图进行相似度分析，结果显示相似度均在0.93以上，且13个共有峰的保留时间RSD值均小于0.18 %，说明该方法具有良好的重复性。
2.5 向天果指纹图谱的建立与分析
2.5.1 特征指纹图谱测定 取30批供试品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件对供试品溶液进行测定。测定结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以S1为参照图谱，经过多点校正，自动匹配，以中位数法得到对照图谱R，在匹配数据的输出结果中选择分离度较好的13个色谱峰作为共有峰，建立30批向天果HPLC指纹图谱共有模式，并通过自制对照品对其中的5个共有峰进行指认，其中1号峰为swietenolide，6号峰为swietenine，8号峰为3,6-O,O-diacetylswietenolide，10号峰为3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide，11号峰为swietemahonin F，结果见图1～2。
图1 30批向天果的特征指纹图谱
图2 向天果HPLC指纹图谱共有模式和对照品图谱
2.5.2 特征指纹图谱的结果分析 经分析计算，30批样品的共有模式中，所有共有峰保留时间RSD值均小于1 %（见表2）；
13个共有峰的峰面积RSD值在11.7 %～37.0 %之间（见表3），表明不同批次向天果中化学成分相差不大，但含量差异较大，不同来源的向天果样品品质有差异。
表3 向天果共有峰的峰面积
表4 30批向天果相似度评价结果
2.5.3 聚类分析 将上述分析数据输入到SPSS 23系统中，进行聚类分析，结果见图3。结果表明30批向天果在阈值为10的情况下被聚为6类，其中有22批样品被聚为一类，说明国内市场上大部分的向天果来自于相似产地；
但根据商家标明的产地，来源相同的样品并未完全被聚为一类，说明商家标明的信息并不可靠；
在阈值为5的情况下，样品被聚为11类，其中6批样品被单独归为一类，表明不同产地来源的向天果含有的化学成分的含量有显著差异。
图3 聚类分析结果
2.5.4 主成分分析 将30批向天果共有峰峰面积作为变量导入SPSS 23软件，进行主成分分析，计算特征值、累计贡献率、成分矩阵及综合得分，具体结果见表5～7。
表5 30批向天果的特征值和贡献率
表6 30批向天果的成分矩阵
表7 主成分得分和综合得分排序
以特征值≥1为提取标准，提取出4个主成分，累计贡献率达77.705 %，可代表向天果中大部分化学成分的含量信息。其中主成分1的信息量最大，贡献率为33.852 %，各色谱峰荷载量代表对应色谱峰的贡献值，贡献值前三的色谱峰分别为：1号峰、6号峰、2号峰。通过主成分综合得分，排名前3位的批号为S4、S17、S7，与聚类分析的结果大体相同，可相互印证。
2.6 指标性成分含量测定
由于目前向天果并无明确的质量标准和含量测定方法，因此根据聚类分析和主成分分析的结果指认共有峰（1号峰：swietenolide和6号峰：swietenine）作为向天果的特征性成分，通过自制对照品对30批样品进行含量测定，建立向天果特征性成分的含量测定方法。
2.6.1 线性关系考察 吸取对照品溶液，分别吸取1，3，5，10，15，20 μl，定容，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，swietenolide的标准曲线为Y=1104.1X-6.1436（r=1，n=6），线性范围为0.488～9.79 μg；
swietwnine的标准曲线为Y=1456.5X-21.864（r=0.9999，n=6），线性范围为0.334～6.68 μg。
2.6.2 精密度试验 取样品S1，按2.3项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，记录峰面积。结果显示swietenolide峰面积的RSD为0.87 %（n=6）；
swietwnine峰面积的RSD为1.23 %（n=6），表明仪器精密度良好。
2.6.3 稳定性试验 取样品S1，按2.3项下方法制备供试品溶液，放置0，4，8，12，16，24 h后依次进样，记录峰面积。结果显示swietenolide峰面积的RSD为1.97 %（n=6）；
swietwnine峰面积的RSD为1.19 %（n=6），表明供试品溶液中成分室温下24 h内具有良好的稳定性。
2.6.4 重复性试验 取S3批次样品0.5 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，进样分析。结果显示swietenolide峰面积的RSD为1.37 %（n=6）；
swietwnine峰面积的RSD为0.93 %（n=6），表明本法重复性良好。
2.6.5 加样回收试验 取样品S1，分别精密称定6份，每份0.25 g，分别加入1.00 mg/ml swietenolide对照品溶液8.55 ml，1.00 mg/ml swietwnine对照品溶液4 ml，按2.3项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积，计算回收率，结果见表8。两对照品的平均回收率分别为99.8 %和101.0 %，RSD分别为1.68 %和3.63 %，符合试验要求。
表8 加样回收试验结果（n=6）
2.6.6 样品含量测定 取30批次供试品（批号：S1～S30），按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果见表9。30批向天果样品中swietenolide和swietwnine的含量平均值分别为14.28，10.74 mg/g。
表9 样品含量测定结果
3.1 色谱条件的选择
柠檬苦素类化合物的紫外吸收大部分为末端吸收，对向天果甲醇提取液在190～400 nm进行全波长扫描，最大吸收集中在210 nm左右。考察了甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1 %磷酸水溶液等多种流动相体系，并对柱温、流速及进样量进行考察，分析比较出峰数目、分离度、峰面积和基线情况。结果显示以乙腈-水、流速1.0 ml/min、柱温30 ℃、进样量20 μl的色谱条件测定时，基线较稳定，出峰较多、分离最好、峰形最佳、保留时间适宜，具有较强的耐用性。
3.2 指纹图谱相似度评价
由本文研究可见，在采用指纹图谱相似度评价向天果药材时，不同产地药材评价的结果会有一定差异，有时不能完全体现批间差异。因此在涉及不同产地药材时应尤其关注类似问题，建议在采用相似度评价的基础上，还应增加主要成分色谱峰单位质量峰面积（A/W）的波动范围，非共有峰个数、共有峰个数及指纹图谱峰形特征、峰面积等指标，并运用统计学方法进行适当的主成分分析和聚类分析，进而对不同产地的药材进行更全面的评价。
3.3 聚类分析和主成分分析
本研究通过主成分分析将30批向天果的13个共有峰峰面积转换成4个相互独立的主成分，避免了原始信息的重叠及干扰，也使数据具有客观性和可比性；
以共有峰峰面积直接区别归类的聚类分析，将相关性大的批次优先聚合在一起。两种分析方法的结果有相似之处，相互佐证，均能较好地反映出不同产地向天果品质的差异性。
本文建立了30批向天果样品的特征指纹图谱，并确立了13个共有峰，指认出其中5个共有峰为柠檬苦素类化合物，表明柠檬苦素类成分为向天果的主要化学成分。比较共有峰保留时间和峰面积的RSD值，结果显示不同来源的向天果样品的化学成分具有一致性，但含量存在一定的差异。后通过聚类分析和主成分分析，深入分析了30批向天果之间品质的差异，并计算出各共有峰的贡献率，以此为基础对贡献率最大的两个共有峰进行含量测定，发现目前我国市场上流通的向天果存在产地信息不明，不同产地的向天果成分含量差异较大等问题，相似度越高的批次之间含量差异越小，反之则越大，在聚类分析中相似度高的批次也基本被分为一类。可见各部分试验结果具有一致性，可相互佐证，所建立的指纹图谱和含量测定方法具有客观性和科学性，可合理地评价该药材质量，为制定向天果的质量标准提供参考依据。
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