向天果HPLC指纹图谱及特征成分含量测定研究

时间:2024-09-10 17:18:01 来源:网友投稿

谢 喆,孙云鹏*,金文芳,刘劲松,王国凯,2*

(1.安徽中医药大学 药学院,安徽 合肥 230012;
2.中药研究与开发安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012)

向天果(FructusSwieteniamacrophylla)为大叶桃花心木(Swieteniamacrophylla)的果实[1],主要分布在热带及亚热带地区。果实味苦、涩,具有收敛、解热等功效,种子主要可用于治疗高血糖、高血压等疾病[2-3]。前期研究表明,向天果中富含柠檬苦素类成分[4-5]。此类化合物不仅结构多样[6],还具有抗氧化[7]、抗肿瘤[8]和抗病毒[9]等生物活性。

目前向天果作为保健品在市场上流通,并无统一的质量标准,不同来源的向天果之间是否存在成分或品质差异是亟待解决的问题。中药指纹图谱能体现中药质量控制的系统性和整体性,被认为是中药质量控制的有效手段[10-11]。本研究通过建立不同来源的向天果指纹图谱,并进行含量测定,结合聚类分析[12],了解各批次向天果之间品质的差异,为向天果的质量控制提供依据。

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱仪(美国Waters 公司);
KQ3200DB型数控超声清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司);
BP211D型电子天平(德国Sartorius)。

1.2 材料

甲醇,乙腈(色谱纯,Sigma公司);
磷酸为分析纯;
蒸馏水(双蒸水);
对照品3,6-O,O-diacetylswietenolide,swietenolide,swietenine,swietemahonin F,3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide均由安徽中医药大学药物化学实验室从大叶桃花心木中分离得到,经薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)确认其性质与纯度,纯度均在95 %以上。

向天果样品(批号:S1~S30)通过电商平台购得,由安徽中医药大学药学院方成武教授鉴定为楝科植物大叶桃花心木(Swieteniamacrophylla)的果实,商家标示的药材产地见表1。

表1 30批向天果样品批号及产地

2.1 色谱条件

色谱柱:KR100-5 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);
流动相A相为乙腈,B相为水,梯度洗脱(0~15 min,45 %~48 %A;
15~35 min,48 %~51 %A;
35~36 min,51 %~55 %A;
36~47 min,55 %~100 %A;
47~54 min,100 %A;
54~55 min,100 %~45 %A);
流速1.0 ml/min;
柱温:30 ℃;
检测波长210 nm;
进样量20 μl。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取5种柠檬苦素类化合物适量,加入适量甲醇溶解,定容,摇匀,配制成一定浓度的对照品溶液,备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定各批次向天果粗粉0.5 g,置25 ml量瓶中,加甲醇20 ml超声提取30 min,冷却后定容,静置,取上清,过微孔滤膜(0.22 μm),备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取样品S1,按2.3项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件连续进样6次,所得色谱图输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”中进行相似度分析,结果显示相似度均在0.98以上,且13个共有峰的保留时间RSD值均小于0.16 %,符合指纹图谱要求。

2.4.2 稳定性试验 取样品S1,按2.3项下方法制备供试品溶液,分别放置0,4,8,12,16,24 h后进样,所得色谱图进行相似度分析,结果显示色谱图相似度均在0.94以上,且13个共有峰的保留时间RSD值均小于0.16 %,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取样品S3,按2.3项下方法制备供试品溶液6份,依次进样,所得色谱图进行相似度分析,结果显示相似度均在0.93以上,且13个共有峰的保留时间RSD值均小于0.18 %,说明该方法具有良好的重复性。

2.5 向天果指纹图谱的建立与分析

2.5.1 特征指纹图谱测定 取30批供试品,按2.3项下方法制备供试品溶液,按2.1项下条件对供试品溶液进行测定。测定结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”,以S1为参照图谱,经过多点校正,自动匹配,以中位数法得到对照图谱R,在匹配数据的输出结果中选择分离度较好的13个色谱峰作为共有峰,建立30批向天果HPLC指纹图谱共有模式,并通过自制对照品对其中的5个共有峰进行指认,其中1号峰为swietenolide,6号峰为swietenine,8号峰为3,6-O,O-diacetylswietenolide,10号峰为3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide,11号峰为swietemahonin F,结果见图1~2。

图1 30批向天果的特征指纹图谱

图2 向天果HPLC指纹图谱共有模式和对照品图谱

2.5.2 特征指纹图谱的结果分析 经分析计算,30批样品的共有模式中,所有共有峰保留时间RSD值均小于1 %(见表2);
13个共有峰的峰面积RSD值在11.7 %~37.0 %之间(见表3),表明不同批次向天果中化学成分相差不大,但含量差异较大,不同来源的向天果样品品质有差异。

表3 向天果共有峰的峰面积

表4 30批向天果相似度评价结果

2.5.3 聚类分析 将上述分析数据输入到SPSS 23系统中,进行聚类分析,结果见图3。结果表明30批向天果在阈值为10的情况下被聚为6类,其中有22批样品被聚为一类,说明国内市场上大部分的向天果来自于相似产地;
但根据商家标明的产地,来源相同的样品并未完全被聚为一类,说明商家标明的信息并不可靠;
在阈值为5的情况下,样品被聚为11类,其中6批样品被单独归为一类,表明不同产地来源的向天果含有的化学成分的含量有显著差异。

图3 聚类分析结果

2.5.4 主成分分析 将30批向天果共有峰峰面积作为变量导入SPSS 23软件,进行主成分分析,计算特征值、累计贡献率、成分矩阵及综合得分,具体结果见表5~7。

表5 30批向天果的特征值和贡献率

表6 30批向天果的成分矩阵

表7 主成分得分和综合得分排序

以特征值≥1为提取标准,提取出4个主成分,累计贡献率达77.705 %,可代表向天果中大部分化学成分的含量信息。其中主成分1的信息量最大,贡献率为33.852 %,各色谱峰荷载量代表对应色谱峰的贡献值,贡献值前三的色谱峰分别为:1号峰、6号峰、2号峰。通过主成分综合得分,排名前3位的批号为S4、S17、S7,与聚类分析的结果大体相同,可相互印证。

2.6 指标性成分含量测定

由于目前向天果并无明确的质量标准和含量测定方法,因此根据聚类分析和主成分分析的结果指认共有峰(1号峰:swietenolide和6号峰:swietenine)作为向天果的特征性成分,通过自制对照品对30批样品进行含量测定,建立向天果特征性成分的含量测定方法。

2.6.1 线性关系考察 吸取对照品溶液,分别吸取1,3,5,10,15,20 μl,定容,按2.1项下色谱条件测定,记录峰面积。以峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线,swietenolide的标准曲线为Y=1104.1X-6.1436(r=1,n=6),线性范围为0.488~9.79 μg;
swietwnine的标准曲线为Y=1456.5X-21.864(r=0.9999,n=6),线性范围为0.334~6.68 μg。

2.6.2 精密度试验 取样品S1,按2.3项下方法制备供试品溶液,重复进样6次,记录峰面积。结果显示swietenolide峰面积的RSD为0.87 %(n=6);
swietwnine峰面积的RSD为1.23 %(n=6),表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取样品S1,按2.3项下方法制备供试品溶液,放置0,4,8,12,16,24 h后依次进样,记录峰面积。结果显示swietenolide峰面积的RSD为1.97 %(n=6);
swietwnine峰面积的RSD为1.19 %(n=6),表明供试品溶液中成分室温下24 h内具有良好的稳定性。

2.6.4 重复性试验 取S3批次样品0.5 g,按2.3项下方法制备供试品溶液,平行制备6份,进样分析。结果显示swietenolide峰面积的RSD为1.37 %(n=6);
swietwnine峰面积的RSD为0.93 %(n=6),表明本法重复性良好。

2.6.5 加样回收试验 取样品S1,分别精密称定6份,每份0.25 g,分别加入1.00 mg/ml swietenolide对照品溶液8.55 ml,1.00 mg/ml swietwnine对照品溶液4 ml,按2.3项下方法平行制备供试品溶液,进样分析,记录峰面积,计算回收率,结果见表8。两对照品的平均回收率分别为99.8 %和101.0 %,RSD分别为1.68 %和3.63 %,符合试验要求。

表8 加样回收试验结果(n=6)

2.6.6 样品含量测定 取30批次供试品(批号:S1~S30),按2.3项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,结果见表9。30批向天果样品中swietenolide和swietwnine的含量平均值分别为14.28,10.74 mg/g。

表9 样品含量测定结果

3.1 色谱条件的选择

柠檬苦素类化合物的紫外吸收大部分为末端吸收,对向天果甲醇提取液在190~400 nm进行全波长扫描,最大吸收集中在210 nm左右。考察了甲醇-水,甲醇-0.1 %磷酸水溶液,乙腈-水,乙腈-0.1 %磷酸水溶液等多种流动相体系,并对柱温、流速及进样量进行考察,分析比较出峰数目、分离度、峰面积和基线情况。结果显示以乙腈-水、流速1.0 ml/min、柱温30 ℃、进样量20 μl的色谱条件测定时,基线较稳定,出峰较多、分离最好、峰形最佳、保留时间适宜,具有较强的耐用性。

3.2 指纹图谱相似度评价

由本文研究可见,在采用指纹图谱相似度评价向天果药材时,不同产地药材评价的结果会有一定差异,有时不能完全体现批间差异。因此在涉及不同产地药材时应尤其关注类似问题,建议在采用相似度评价的基础上,还应增加主要成分色谱峰单位质量峰面积(A/W)的波动范围,非共有峰个数、共有峰个数及指纹图谱峰形特征、峰面积等指标,并运用统计学方法进行适当的主成分分析和聚类分析,进而对不同产地的药材进行更全面的评价。

3.3 聚类分析和主成分分析

本研究通过主成分分析将30批向天果的13个共有峰峰面积转换成4个相互独立的主成分,避免了原始信息的重叠及干扰,也使数据具有客观性和可比性;
以共有峰峰面积直接区别归类的聚类分析,将相关性大的批次优先聚合在一起。两种分析方法的结果有相似之处,相互佐证,均能较好地反映出不同产地向天果品质的差异性。

本文建立了30批向天果样品的特征指纹图谱,并确立了13个共有峰,指认出其中5个共有峰为柠檬苦素类化合物,表明柠檬苦素类成分为向天果的主要化学成分。比较共有峰保留时间和峰面积的RSD值,结果显示不同来源的向天果样品的化学成分具有一致性,但含量存在一定的差异。后通过聚类分析和主成分分析,深入分析了30批向天果之间品质的差异,并计算出各共有峰的贡献率,以此为基础对贡献率最大的两个共有峰进行含量测定,发现目前我国市场上流通的向天果存在产地信息不明,不同产地的向天果成分含量差异较大等问题,相似度越高的批次之间含量差异越小,反之则越大,在聚类分析中相似度高的批次也基本被分为一类。可见各部分试验结果具有一致性,可相互佐证,所建立的指纹图谱和含量测定方法具有客观性和科学性,可合理地评价该药材质量,为制定向天果的质量标准提供参考依据。

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