凌娜，徐贵国，李玮璐，刘小瑞
（哈尔滨商业大学药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）
杜氏盐藻（Dunaliella salina）是一种极端嗜盐、无细胞壁、营光合自养的单细胞真核绿藻。藻体富含β-胡萝卜素、甘油、多糖、蛋白质素等多种活性物质，常作为水产养殖中鱼、虾、贝类幼体的饵料[1,2]。铜是细胞内多种酶的活性中心，如质体蓝素、铜/锌超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等，参与细胞中光合作用的电子传递、叶绿素、维生素以及蛋白质和碳水化合物的生物合成，是植物生长发育必需的微量元素。铜缺乏会导致植物细胞生长受抑，光合作用和呼吸作用速率降低；
但铜过量也会对植物产生明显的毒性效应，如生长不良、光合作用受抑制，严重时甚至死亡[3,4]。
采用转录组测序技术（RNA-Seq）可以获得特定条件或状态下细胞中全部的转录本，揭示生物体中一些特殊的生物学现象及其发生机制；
分析表达基因差异可从整体上诠释基因的结构与功能[5]。RNA-Seq 已广泛应用于植物、动物以及人的各种生理、病理条件下RNA 的测序和分析[6-8]，在植物或藻类中筛查出大量的胁迫导致的差异表达基因，对这些差异基因进行功能注释和代谢通路分析，可探究植物或藻类响应逆境胁迫的分子机理[9-12]。转录组测序技术也应用于杜氏盐藻的测序和分析中。刘军立等[13]用RNA-Seq 技术筛查出了杜氏盐藻中与淀粉和脂质代谢路径相关的关键酶，如磷酸葡萄糖转移酶、淀粉磷酸化酶、乙酰辅酶A 羧化酶等。朱立强等[14]对杜氏盐藻全转录本进行测序和功能注释分析，建立了该藻的转录组数据库。高盐胁迫下的转录组分析发现，杜氏盐藻细胞内与光合作用、碳固定和血红素生物合成、蛋白质转换、剪接体、内质网蛋白质加工和内吞作用以及淀粉的降解、甘油的合成等相关的基因显著上调[15,16]。
盐藻对铜胁迫的反应是一个极其复杂的生理过程，不仅引起细胞形态学和生理学的变化，还能导致细胞中多个基因和信号通路的改变。本研究基于Illumina HiSeq2500 技术平台，探讨在铜胁迫下杜氏盐藻的转录本在不同信号途径上的表达，筛查铜胁迫下的差异表达基因，并注释这些基因的功能和聚类分析，深度挖掘铜胁迫下杜氏盐藻中与光合作用相关的基因的表达，为揭示盐藻铜处理下正常的生物学现象和铜耐受的机制提供一定的理论依据。
1.1 材料
杜氏盐藻（Dunaliella salina）来源于宁波大学海洋生物工程重点实验室，采用f/2 培养基，在（24±1）℃，pH 7～8，光强54～90 μmol/（m2·s），光暗周期12h∶12h 下培养。实验设正常f/2 培养基培养的对照组和铜处理组。前期铜对盐藻生长72 h 的EC50为9.55 mg/L[17]，选择与1/2 EC50相当的5 mg/L CuCl2作为铜处理组，培养72 h，每组3 次重复。
1.2 杜氏盐藻无参转录组的构建
1.2.1 RNA 提取及样品检测
培养完成时收集盐藻细胞，采用Invitrogen 公司的Trizol 试剂盒提取藻细胞中总RNA，然后检测提取的RNA 样品浓度、纯度和长度等质量，确保符合文库构建标准。
1.2.2 文库构建
质检合格后，用带有Oligo（dT）磁珠富集真核生物的mRNA，然后加入裂解缓冲液，将mRNA 消化成150～200 nt 的短片段；
以短片段mRNA 为模板，用6 碱基随机引物反转录合成cDNA 第一链，然后合成cDNA 第二链，并利用试剂盒纯化双链cDNA；
纯化后的cDNA 进行黏性末端修复，随后在cDNA的3"-端加上poly-A 并连接接头，最后选择片段大小和PCR 扩增构建cDNA 文库。
1.2.3 文库质检
构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer 检测片段大小，ABI StepOnePlus Real-Time PCR System定量文库浓度。
1.3 转录组测序及生物信息学分析
1.3.1 上机测序及数据质控
转录组测序和生物信息学分析委托成都生命基线有限公司和上海美吉有限公司完成。采用Illumina HiSeqTM2500 测序仪进行测序，得到的原始数据参照公司标准进行质控，获得可用于后续分析的高质量clean reads。Clean reads 经Trinity 软件de novo 组装，过滤掉低质量的转录本，获得transcript可用于后续转录本注释和定量分析等。
1.3.2 转录本功能注释
将组装得到的转录本与6 大功能性数据库（NR、GO、COG、KEGG、Pfam 和Swiss-Prot）比对进行基因注释，从整体水平评估转录本组装的完整性；
同时检测转录本的SNP 和SSR 结构。
1.3.3 差异表达基因分析
基因在转录本水平表达的高低是其丰度的直接反应，采用DEGseq 软件（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEGseq.html）筛 选 出正常培养及铜胁迫条件下不同样本中表达量显著变化的基因，对这些差异基因进行GO 和KEGG Pathway 富集分析。
2.1 转录组测序
通过Illumina HiSeq2500 对对照组和铜处理组盐藻的转录组进行测序和组装，筛除冗余序列和短片段后获得的cleans reads 中分别获得57 093 个transcripts 和41 418 个unigenes。大多数转录本长度分布在200～1 000 bp。Transcript 和unigene 的N50和GC 含量分别为2 306 bp、56.19%和2 118 bp、57.23%。表明测序质量较高，转录本适合后续注释分析。
2.2 功能注释
对照组与铜处理组盐藻细胞的转录组测序获得的所有unigene 与NR、GO、COG、KEGG、Swiss-Prot 和InterPro 几个数据库进行对比和功能注释。结果发现有36 422 个unigenes 注释到这几个数据库，其中NR、COG、KEGG、Swiss-Prot 和InterPro 数据库比对上的unigenes 分别有22 204、19 524、15 345、12 136 和18 016 个，重叠区域共有unigene 7 605 个（图1）。
图1 功能注释韦恩图Fig.1 Venn diagram of functional annotation
2.3 物种同源性比对
在NR 数据库中，对获得的unigene 的同源性比对发现，注释的unigene 与变异小球藻（Chlorella variabilis）、胸状盘藻（Gonium pectorale）、长棘卷尾藻（Volvox carteri f.nagariensis）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtli）、亚椭圆球藻C-169（Coccomyxa subellipsoidea C-169）、原鞘小球藻（Auxenochlorella protothecoides）的同源性较高，分别达到25.60%、14.02%、12.02%、10.42%、7.29%和7.08%；
与绿色杜氏藻（Dunaliella viridis）和杜氏盐藻（Dunaliella salina）的相似性仅为1.42%和0.92%（图2）。原因可能是在公共数据库中盐藻的全基因组序列和注释信息尚不全面，有很多unigene 没有被比对上，导致同源性比对时同物种的相似性较低。
图2 物种同源性比对Fig.2 Homology comparison of species
2.4 COG 注释
基于COG 功能注释，19 524 个unigene 主要参与代谢、细胞过程及信号、信息的储存与加工及其他4 个大类，又被细分为22 个类别，其中最丰富的类群是“翻译后修饰、蛋白折叠、伴侣（1 418）”、“翻译、核糖体结构和生物起源（862）”、“复制、重组和修复（841）”、“胞内运输、分泌和液泡运输（836）”、“信号转导机制（760）”和“转录（594）”。另外，还参与糖类转运和代谢、氨基酸转运和代谢、能量的产生和转换、无机离子转运和代谢、脂类转运和代谢、辅酶转运和代谢的unigene 分别为585、563、509、429、359、286。尚有10009 个unigene 功能未知（表1）。
表1 COG 功能注释Tab.1 COG functional annotation
2.5 差异表达基因聚类分析
采用DESeq2 软件对获得的基因/转录本进行差异表达分析，筛选条件为Padjust<0.05，|log2FC|≥1。结果在铜处理组和正常培养组的盐藻细胞中共筛选出3 799 个差异表达基因（DEGs），其中表达上调的基因为2 350 个，表达下调的基因为1 499 个（图3-A）。根据FPKM 值进行表达模式聚类分析，红色代表unigene 在样本中表达量较高，蓝色表示表达量较低。图3-B 为3 799 个差异表达基因热图分析，其中基因结构和功能相似的基因聚为一类，这些基因群可能在盐藻生命活动及新陈代谢中发挥类似的功能。
图3 差异表达基因统计及模式分析Fig.3 Statistics and pattern analysis of differentially expressed genes（DEGs）
2.6 差异表达基因的GO 富集分析
采用Blast2GO 软件对铜处理后的差异表达基因进行GO 富集分析，发现有1 719 个差异表达基因（DEGs）富集到GO 的三个类别。在生物学进程（Biologcial process，BP）中，差异表达基因主要富集在DNA 代谢进程（DNA metabolic process,194）、细胞对胁迫和刺激的响应（Cellular response to stress and stimulus，126 和128）、细胞周期进程（Cell cycle process，65）、染色体组织（Chromosome organization，57）、DNA 复制（DNA replication，45）、有丝分裂细胞周期进程（Mitotic cell cycle process，34）、组蛋白磷酸化（Histone phosphorylation，9）、端粒组织和维持（Telomere organization and maintenance，36）、细胞周期检测点（Cell cycle checkpoint，21）、结构内稳态（Anatomical structure homeostasis，18）。在细胞组分（Cellular component,CC）中，差异基因主要参与膜组分（Integral component of membrane，812）、质体（Plastid，129）、叶绿体（Chloroplast，122）的合成。差异基因的分子功能（Molecular function,MF）主要富集在DNA 结合（DNA binding，226）、RNA 聚合酶活性（RNA polymerase，28）、组蛋白甲基转移酶活性（Histone methyltransferase activity，43）等（图4）。
图4 差异表达基因的GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed genes
2.7 差异表达基因的KEGG 富集分析
将铜处理后的差异表达基因进行KEGG 富集分析，以P<0.5 为筛选条件，-log10（P-value）和DEGs 数量为横坐标（图5）。差异基因显著富集的途径为光合作用（Photosynthesis，25）、DNA 复制（DNA replication，26）、RNA 聚合酶（RNA polymerase，21）、同源重组（Homologous recombination，27）、嘧啶代谢（Pyrimidinemetabolism，39）、嘌呤代谢（Purinemetabolism，39）等，说明铜处理主要影响盐藻细胞的生长、遗传发育和基础代谢。
图5 差异表达基因的KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes
2.8 与光合作用及糖酵解相关的差异表达基因
KEGG 富集分析表明，铜处理显著诱导了与光合作用及糖代谢相关基因的表达。这些基因主要与光系统膜蛋白复合物、光合电子传递链、天线蛋白、碳固定和糖酵解等有关。在铜处理下PSII 蛋白复合物编码基因psbA、psbB、psbC、psbE、psbH、psbM、psbP、psbO、psbZ 以及PSI 蛋白复合物psaC 表达上调。编码细胞色素b6/f 复合物亚基的基因petB 和petC 表达上调，而编码PetH 蛋白的基因表达下调。编码ATP 合成酶α、β 和c 亚基的3 个基因表达也上调。而编码光捕获复合物叶绿素的基因lhca3和lhcb4 表达上调，lhca1 和lhcb2 的基因表达下调（表2）。这些基因在光合作用电子传递和ATP 合成中发挥重要作用。铜是光合作用中电子传递体质体蓝素的活性中心，通过蛋白质中铜离子的氧化还原变化来传递电子。本研究结果表明，适量的铜能显著激活盐藻细胞中PSI-LHCI 超复合物，加快光合电子传递，促进盐藻的生长和光合作用。
表2 与光合作用及糖酵解相关的DEGs 表达Tab.2 Expressions of DEGs related to photosynthesis and glycolysis
铜处理还影响盐藻细胞中与碳固定及糖酵解相关的基因表达，如编码核酮糖1,5 二磷酸羧化酶大亚基（RbcL）、转酮醇酶（TktA）、苹果酸脱氢酶（Mdh1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（Gapdh）、磷酸丙糖异构酶（Tpi）的基因表达上调，而编码柠檬酸合成酶（Cs）、琥珀酸脱氢酶（Sdh）、丙酮酸激酶（Pyk）的基因表达下调（表2）。结果表明，适量的铜可以促进盐藻细胞中碳代谢及糖酵解过程，加速细胞的碳同化作用。
2.9 与离子转运及胁迫相关的差异表达基因
植物和藻类已经进化出一个复杂的自稳态网络系统，调节细胞内外铜的摄入、运输、分配及铜胁迫响应系统。铜的摄取和转运过程中有多种蛋白参与，包括铜转运蛋白、金属伴侣蛋白、P 型ATP 酶等[18]。由表2 可知，编码铜转运蛋白P1B-型ATPase 的基因copA、copB，锌铁转运蛋白基因zip，及液泡转运蛋白的基因vps-4 和vps-36 表达上调。与ABC 超家族跨膜转运相关的基因表达也升高，主要有抗氧化防御系统和热休克蛋白/分子伴侣。铜胁迫还激活了盐藻细胞中抗氧化防御系统及热休克蛋白网络，表现为编码Cu/Zn-SOD 和过氧化氢酶Cat 的基因显著上调；
热休克蛋白/分子伴侣网络中hsp20、hsp33、dnaK 和dnaJC13 的基因显著上调，而hsp70、groEL、dnaJC7 和dnaJC11 的基因显著下调（表2）。
2.10 基因结构分析
2.10.1 SSR 标记分析
简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR），又称为短串联重复序列（simple tandem repeats,STRs）或微卫星标记（microsatellite），是一类由几个核苷酸（1～6 个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，广泛分布于真核生物基因组中，也是目前应用最广泛的分子标记技术之一。本研究发现41 418 条unigene 序列中各种SSR 位点18 097个，SSR 发生频率为43.69%。从SSR 重复类型中发现，杜氏盐藻转录组中出现最多的是三核苷酸重复，占总SSR 位点数目的65.64%；
其次是单核苷酸重复和双核苷酸重复，分别占总SSR 位点数量的13.65%和18.68%。在三核苷酸重复中，AGC/CTG 这种SSR 重复位点最多，占87.51%；
其中重复次数为1～5 和6～10 的SSR 位点最多，分别占总SSR 的23.98%和56.78%（图7）。这些重复序列可作为杜氏盐藻独特的分子标记，用于后续SSR 引物设计、基因定位、谱系分析、亲缘关系鉴定等。
图7 杜氏盐藻中SSR 重复基元的类型Fig.7 SSR repeat motifs in green alga Dunaliella salina
2.10.2 SNP 位点分析
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）指碱基序列上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、插入和缺失，是第三代分子遗传标记技术，可用于分析基因功能与表型性状之间的关系。目前尚未有关于杜氏盐藻SNP 标记的相关报道。本研究中，杜氏盐藻转录组分析共有41 418 条unigene，检测到35 282 个SNP 位点，平均每条unigene 含有0.85 个SNP 位点，其中转换22 884 个（64.86%），颠换12 398 个（35.14%）。6 种单核苷酸变异中，A-G 和C-T 发生的频率最高，分别达到33.33%和31.52%；
其他4 种单核苷变异中，A-C、A-T、C-G 和G-T 的频率分别为10.47%、7.18%、7.07%和10.42%（图8）。本研究极大地丰富了杜氏盐藻SNP 的位点信息，为后续盐藻分子遗传和表型性状的分析提供一定的参考依据。
图8 杜氏盐藻中SNP 位点分析Fig.8 SNP site analysis in green alga Dunaliella salina
铜是植物和藻类生长所必需的一种微量金属元素，广泛存在于水体和土壤环境中，高浓度时对水生和陆地生物具有一定的毒性。铜对杜氏盐藻的生长、光合色素的合成、蛋白质和多糖的含量等均有一定的影响[17]，低浓度下促进藻类的生长，高浓度下抑制藻类的生长，表现出典型的hormesis 效应[19,20]。但是，铜胁迫对杜氏盐藻基因表达和信号通路的影响以及铜的转运和代谢等机制目前尚不清楚。
本研究通过RNA-Seq 技术从转录水平探讨杜氏盐藻基因表达与铜胁迫之间的关系。从对照组和铜处理组共得到41 418 个unigenes，筛选出3 799个差异表达基因，其中2 350 个基因表达上调，1 449个基因表达下调。这些差异表达基因主要富集在光合作用、DNA 复制、RNA 聚合酶、同源重组等基础代谢过程。光合作用中与光系统膜蛋白复合物、光合电子传递链、ATP 的合成、碳固定、糖酵解等相关的基因表达上调。结果表明，一定浓度的铜离子可以促进盐藻的生长和光合作用，而光合作用的增强反过来提高盐藻对铜的耐受性。
植物和藻类细胞中，铜的同化和运输受到铜转运体CTR/COPT 家族的调控，并通过P-型ATPase泵入细胞进行跨膜运输[21]。本研究发现，铜处理可特异性地激活一系列编码铜转运蛋白、ABC 转运体、液泡转运蛋白、抗氧化防御系统及热休克蛋白超家族基因的表达。结果表明，铜可以通过铜转运体或伴侣转运到细胞中，然后转移到叶绿体中的质体蓝素，最终导致光合作用和碳代谢的增强。另一方面，细胞中过量的铜可以通过液泡转运体被泵入或泵出细胞。
本研究与其他类似的研究报道结果一致。Beauvais-Flück 等[21]报道，在10-6mol/L 铜环境下暴露2 h 后，莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和伊乐藻（Elodea nuttallii）共有1 397 个和1 258 个基因差异表达。这些基因主要参与能量代谢、离子转运、细胞过程、应激、抗氧化代谢和发育等。氧化戊糖磷酸途径、硝酸盐代谢和金属处理等代谢过程仅在伊乐藻中被发现，而细胞运动、多胺代谢、线粒体电子传递和三羧酸循环等为莱茵衣藻所特有。铜和H2O2胁迫处理可诱导褐藻长囊水云（Ectocarpus siliculosus）发生氧化应激，表现为激活oxylipin 信号通路，抑制肌醇信号通路。铜胁迫特异性地激活了一系列编码ABC 转运蛋白、P1B 型ATP 酶、ROS 解毒系统等基因的表达，诱导游离脂肪酸含量的增加[22]。另有研究发现，杜氏盐藻通过提高光合作用、碳固定、蛋白质合成等基因的表达增强其耐盐性[16]。
与此同时，预测和鉴定差异基因功能时，发现仅有55.04%的基因有明确的功能注释信息，尚有39.04%的差异基因功能未知。杜氏盐藻基因组信息尚未完全解析，提示这些未知基因可能是新基因，它们在盐藻铜耐受方面可能发挥重要作用。这方面有待于进一步的挖掘和探讨。课题组计划在下一步实验中，针对杜氏盐藻中与铜胁迫相关的路径如光合作用、离子转运、氧化应激、逆境胁迫等相关的基因和代谢通路进行深入的挖掘和剖析，并进行基因表达分析和功能验证，明确铜胁迫对杜氏盐藻的生长及代谢活动的影响。本研究结果可为深入的探索和挖掘新基因、揭示新基因的功能以及盐藻铜耐受机制提供一定的理论依据。
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