刘玲玲, 李政升, 刘 颖
(青海大学畜牧兽医科学院,青海省高寒草地适应性管理重点实验室/青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室, 西宁 810016)
青海省是我国生态大省,亦是国家首批生态文明先行区试点省份,但随着全球气候变化、降水错位、草原退化加剧等问题的出现,对青海省内生态发展提出了重大挑战[1]。众多研究者在生态恢复发展重点及建议中提及优质乡土草种的驯化选育是当前工作中的重难点,也是目前青海省生态发展及退化恢复工作的必经之路[2-3]。
地梢瓜(Cynanchumthesioides)、鹅绒藤(Cynanchumchinense)和华北白前(Cynanchumhancockianum)均为萝藦科鹅绒藤属植物,广泛分布于青海、内蒙古、山西、陕西、甘肃等半干旱地区。地梢瓜为饲药食兼用的多年生直立半灌木,多生长于山坡、沙丘或干旱山谷、荒地等处[4]。鹅绒藤为多年生缠绕草本植物,多生长于灌木丛、河畔或田梗边[5]。华北白前为多年生直立草本植物,生长于山坡、草甸、沟谷及林缘等地。地梢瓜、鹅绒藤和华北白前以其广泛的适应性和强劲的生命力为生态恢复中优质种质资源的驯化培育提供了选择,但目前对这3种植物的研究主要集中在化学成分提取和药理活性探索方面[6-8],对其原生生态适应性和栽培技术的相关研究尚属空白,这直接或间接限制了3种优质植物资源巨大生态价值的挖掘和利用。但野生种质由于种种原因,其自然萌发率通常较低,而优质草种的成功建植取决于快速整齐的种子萌发[9]。故此,对上述3种优质鹅绒藤属植物资源进行萌发测定及引发剂筛选等基础性研究工作迫在眉睫。
种子萌发及幼苗生长是植物生命周期的第一阶段,也是对外界环境最为敏感的阶段之一[10]。在生产中,种子萌发和幼苗生长受到多种环境条件制约,干旱是主要制约因素之一。在此阶段,干旱胁迫会通过产生低渗透势阻止植物对水分的吸收从而抑制种子萌发和幼苗生长,进而使植物的整个生命周期受到影响,最终导致低产和劣质[11]。因此,技术性解决干旱造成的种子萌发受限是亟待探索的问题。
种子引发已被证实是一种可行的播前种子处理技术,可改善不利环境条件下种子萌发和幼苗生长性能[12-13]。引发的种子在生理上接近萌发阶段,其种子活力、种苗外观形态和种苗质量都有所提高,从而弥补了不同种子由于自身差异而导致的萌发不整齐和生长不一致的缺陷[14]。目前,多种引发剂已应用于实际生产中,其中以H2O、KMnO4、H3BO3、H2O2、PEG等引发剂应用最为广泛[15]。此外,引发剂的引发效果亦受到植物种类的影响,相同引发剂在不同植物中的引发效应因植物种类的不同而有差异[16]。鉴于此,本研究以3种鹅绒藤属植物野生种子为供试材料,经过引发处理筛选能优化其萌发的引发剂,在此基础上进行干旱逆境下的引发检验,以期为后续地梢瓜、鹅绒藤和华北白前的人工引种栽培研究及实践生产奠定基础。
1.1 试验材料
供试材料为野生地梢瓜、鹅绒藤和华北白前种子,均采自青海省海南藏族自治州贵德国家地质公园月亮湾内(东经101°53′,北纬36°09′,海拔2 050 m),该地属高原大陆性气候,无霜期258 d,年降水量400 mm左右,蒸发量1 500 mm左右,年平均气温7.2 ℃,年平均日照时数2 928 h,为典型的黄土高原与青藏高原过渡沟壑纵横干旱区。
1.2 试验设计
试验分为两个阶段,第一阶段为3种鹅绒藤属植物有效引发剂筛选试验。选用生产上常用的5种引发剂为试验因素(表1),以未处理过的干种子作为对照,筛选3种引发效果最优的引发剂作为第二阶段的引发因素。第二阶段为引发剂处理后种子对干旱胁迫的响应效果研究。设引发剂和干旱两个处理因素,其中引发剂为第一阶段筛选出的3种引发效果最好的溶液,干旱设两个水平,即N0和N1,用PEG-6000模拟(表1)。
1.3 试验方法
试验采用纸上发芽法,选取籽粒饱满,大小均匀一致、无损伤的野生地梢瓜、鹅绒藤和华北白前种子,用5%次氯酸钠溶液消毒15 min,用蒸馏水冲洗表面残留化学物质后吸干表面水分,将其放入盛有不同引发剂的小烧杯中,浸泡24 h后,用蒸馏水反复漂洗种子4～5次,吸干表面水分。在每个铺有双层滤纸的培养皿中均匀铺放50粒处理过的种子,加水或15% PEG(第一阶段加水,第二阶段加15% PEG)7 mL,并做好标记,每个处理3次重复。将培养皿置于光照培养箱(MGC-250,上海)中,萌发条件设为25 ℃/20 ℃(昼温/夜温),光周期12 h/12 h(光照/黑暗),光照强度1 250 lx。试验期间每天补充适量水分(或15% PEG),并观察、记录发芽种子数量。试验以幼根伸出种皮0.2 cm作为萌发标准。
1.4 测定指标
试验结束后,从各处理的培养皿中选取10株具有代表性且生长一致的植株,用电子游标卡尺测量根长和芽长,随后计算各处理下萌发率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间和萌发整齐性指数[17-19],计算公式如下:
萌发率/%=(7 d内发芽种子数/供试种子数)×100%
(1)
发芽势/%=(5 d内发芽种子数/供试种子数)×100%
(2)
(3)
活力指数=GI×S
(4)
(5)
(6)
式中,GI为发芽指数,Ni表示在第i天萌发的种子数量,Ti表示从试验开始到第i天的时间,S为平均根长+平均芽长。
采用隶属函数法对几种引发剂引发效果进行综合评价[20-21]。当测定指标为正向指标时,采用公式(7),当测定指标为负向指标时,采用公式(8),隶属度的计算采用公式(9),代表种子萌发参数的平均隶属值,其值越大代表该处理下引发效果越好。
X(μi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)
(7)
X(μi)=1-(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)
(8)
隶属度=∑(X(μ1)+X(μ2)+…+X(μn))/n
(9)
式中:Xi为鹅绒藤属植物中i指标的测定值;i=1,2,3…n,Ximin为该指标测定值的最小值;Ximax为该指标测定值的最大值,n为测定指标数量。
1.5 数据分析
采用SPSS22.0、Microsoft Excel2017软件进行数据统计与分析,采用Duncan法进行差异显著性多重比较,采用Origin Pro2018软件绘图。每次试验重复3次,数据以平均值±标准差表示,差异显著性水平为p<0.05。
2.1 3种鹅绒藤属植物有效引发剂筛选
2.1.1不同引发剂对3种鹅绒藤属植物萌发的影响
不同引发剂处理后,种子萌发效果不同(表2)。地梢瓜种子的自然萌发率仅为52.67%,除S3外,其余引发处理均显著提高其萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数,其中S4的引发效果最好,与S0相比,可使萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数分别上升77.20%,101.48%,111.36%和206.28%,S1、S2、S3、S4处理能显著缩短地梢瓜种子的平均发芽时间,而S5处理能显著提高其萌发整齐性指数。鹅绒藤种子的自然萌发率为93.33%,S3处理对其萌发有显著抑制作用,而S2、S4、S5处理对其萌发有显著促进作用,经过S2、S4和S5的引发处理,鹅绒藤种子的萌发率可达100%,尤其在S4处理下,其平均发芽时间缩短了1.07 d。华北白前种子的自然发芽率为90.00%,S3处理显著降低其萌发率,但对其发芽势没有显著影响,所有引发处理均显著提高了其发芽指数,缩短了平均发芽时间,S2和S5处理显著降低了种子的活力指数,但只有S2处理后种子的萌发整齐性指数显著降低。
表2 引发剂处理后3种鹅绒藤属植物的萌发参数
2.1.2不同引发剂对3种鹅绒藤属植物根长和芽长的影响
不同引发剂处理对种子萌发后根长和芽长的影响不同,不同种子对同一引发剂的响应效果也不同(图1)。于地梢瓜种子而言,S4处理能显著促进芽的生长,与对照相比,可使芽长增加43.19%,而S2处理能显著促进根的生长,可使根长增加132.01%,S3处理则对芽和根的生长均有显著抑制作用,根长和芽长分别下降38.79%和39.07%,其余处理与对照之间差异不显著。S1和S3处理对鹅绒藤种子萌发后芽和根的抑制作用显著,S4处理既有利于芽的生长,又对根的生长有显著促进作用,另外,S2处理也可显著促进鹅绒藤根的生长。于华北白前而言,S1处理最有利于芽和根的生长,S3和S4处理对华北白前根的影响不显著,但S3处理可显著促进其芽的生长,S5处理对芽和根的生长均有显著抑制作用。
图1 引发剂处理对根长和芽长的影响
2.1.3隶属函数综合评价
对地梢瓜、鹅绒藤和华北白前的萌发率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间、萌发整齐性指数6项萌发指标进行隶属函数综合评价,发现不同植物对引发剂的响应效果不同(表3)。对地梢瓜的引发效果S4>S5>S1>S2>S0>S3,对鹅绒藤的引发效果S4>S2>S5>S1>S0>S3,对华北白前的引发效果S1>S4>S5>S0>S3>S2。可以看出,对地梢瓜和华北白前引发效果最好的3种引发剂分别是H2O、0.3% H2O2和5% PEG,对鹅绒藤引发效果最好的3种引发剂分别是0.5% KMnO4、0.3% H2O2和5%PEG,将其分别作为后续3种鹅绒藤属植物干旱胁迫试验的引发剂。
表3 3种鹅绒藤属植物萌发的隶属函数综合评价
2.2 3种鹅绒藤属植物种子引发后对干旱胁迫的响应效果
2.2.1干旱胁迫下引发剂对3种鹅绒藤属植物萌发的影响
干旱胁迫影响种子萌发,引发剂处理可改善干旱条件下种子萌发状况(表4)。干旱胁迫对地梢瓜的萌发率和平均发芽时间没有显著影响,说明地梢瓜种子在干旱胁迫下能正常萌发。S1、S4和S5处理能显著提高干旱胁迫下地梢瓜萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数,且S4处理能显著缩短其平均发芽时间并提高萌发整齐性指数。干旱胁迫对鹅绒藤和华北白前的萌发均产生显著影响,具体表现在萌发率、发芽势、发芽指数、活力指数等萌发参数的降低,而引发剂处理可改善鹅绒藤和华北白前在干旱胁迫下的种子萌发受限情况,S2、S4和S5处理均能提高干旱胁迫下鹅绒藤的萌发率和发芽势,缩短平均发芽时间,但S5处理的效果未达显著水平。S1和S4能显著改善华北白前在干旱逆境下的萌发状况,使之与未引发相比,其萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数显著上升,平均发芽时间明显缩短,而S5则对其萌发产生不利影响,限制种子萌发生长。
表4 干旱胁迫下3种鹅绒藤属植物种子引发后的萌发参数
2.2.2干旱胁迫下引发剂对3种鹅绒藤属植物根长和芽长的影响
干旱胁迫对3种鹅绒藤属植物根和芽的生长均有显著抑制作用,而适当的引发剂处理可在一定程度上缓解这种抑制(图2)。干旱胁迫下,地梢瓜、鹅绒藤和华北白前的根长分别下降32.36%,26.60%和73.52%,芽长分别下降46.93%,32.84%和75.50%。S1、S4和S5处理均可缓解干旱胁迫对地梢瓜根和芽生长的抑制,交互作用,其他同理。
图2 干旱胁迫下引发剂处理对根长和芽长的影响
并且S1和S4的缓解效果达到显著水平。S2和S4处理可缓解干旱胁迫对鹅绒藤根和芽生长的抑制作用,且S4的缓解效果达到显著水平,能使鹅绒藤的根长和芽长分别增加25.05%和51.00%,而S5处理则抑制了其根和芽的生长,且对芽的抑制作用显著。S1和S4处理均能促进干旱胁迫下华北白前根和芽的生长,并均达到显著水平,S5则抑制了根和芽的生长,但与对照(S0N1)相比抑制作用不显著。
2.3 物种、干旱胁迫、引发剂及其互作效应对种子萌发的影响
三因素方差分析表明,物种、干旱胁迫、引发剂及其互作效应对种子萌发和幼苗生长均有影响(表5)。物种、干旱胁迫和引发剂三因素交互作用对3种鹅绒藤属植物萌发率和萌发整齐性指数的影响不显著,其余因素及其交互作用对萌发率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间和萌发整齐性指数的影响均达到极显著水平。
表5 物种、干旱胁迫、引发剂及其互作效应对种子萌发的影响
种子引发主要是通过控制种子缓慢吸水,激活种子生理生化代谢和修复作用,使种子的细胞膜、细胞器酶活化处于预发芽状态[22]。种子引发可缩短种子萌发时间,提高抗氧化酶活性,阻止或减少活性氧的不利影响,进而促进植物生长[23]。本研究发现,不同引发剂对地梢瓜种子萌发的促进效果为S4>S5>S1>S2>S0>S3,对鹅绒藤种子的引发效果S4>S2>S5>S1>S0>S3,对华北白前种子的引发效果S1>S4>S5>S0>S3>S2。可以看出,0.2 g/L H3BO3处理抑制了3种鹅绒藤属植物的萌发生长,而王少平等[24]研究表明,0.2 g/L H3BO3对蜀葵(Althaearosea(Linn.) Cavan.)种子萌发有显著促进作用,这与本研究的结果相反,说明不同植物对同一引发剂的响应效果不同,0.2 g/L H3BO3并不适合作为地梢瓜、鹅绒藤和华北白前的引发剂使用。0.5% KMnO4对华北白前有负向引发作用,但能显著促进地梢瓜和鹅绒藤的萌发,这也说明了同一引发剂对不同植物的引发效果存在差异。H2O作为引发剂在生产中使用较广,均能提高3种鹅绒藤属植物萌发率和活力指数,缩短发芽时间,是一种低耗有效的引发剂。5% PEG可显著促进3种植物种子萌发,肖爽等[25]的研究也得出了这一结论,PEG引发可增强种子内部抗氧化酶活性,降低脂质过氧化水平,进而促进种子萌发;但5% PEG对华北白前根和芽的生长有显著抑制作用,可能是华北白前的干旱耐受性较差,虽然PEG引发激活了种子生理生化代谢过程,提高了萌发率,缩短了发芽时间,但抑制了种子活力,从而减慢了生长发育的速度。0.3% H2O2对3种鹅绒藤属植物均有很好的引发效果,有研究推测H2O2作为信号分子可通过增强α-淀粉酶活性来改善种子萌发和活力[26]。
干旱是限制植物生长发育的主要非生物胁迫之一,缺水会增加细胞膜的通透性,引起K+外流,扰乱植物代谢,从而影响植物生长[27]。关正等[28]对苘麻的研究表明,低浓度干旱胁迫能促进种子萌发,而高浓度胁迫则会抑制或完全抑制萌发,原因可能是当水分充足时,种子会通过“积极回应”策略来促进自身萌发,相反种子则会通过“规避”策略来推迟自身萌发。本研究表明,15% PEG干旱胁迫显著抑制了鹅绒藤和华北白前种子的萌发,具体表现在萌发率、发芽势、发芽指数、活力指数等萌发参数的降低。15% PEG干旱胁迫对地梢瓜萌发率、平均发芽时间和萌发整齐性指数的影响不显著,但其发芽势、发芽指数和活力指数明显受到抑制,说明地梢瓜对干旱逆境具有较强抵抗能力,在15% PEG干旱逆境下可正常萌发,但种子活力受到抑制,影响其后期生长。另外,干旱胁迫下3种鹅绒藤属植物根和芽的生长均受到显著抑制,可能是干旱胁迫减少了植物对水分的利用,抑制了根和芽顶端分生组织细胞的生长和分裂所致。
适宜的引发剂处理可改善植物在逆境胁迫下的生长状况[29-30]。而种子引发可通过调节抗氧化防御系统来缓解干旱诱导的氧化损伤。Mazhar等[31]研究表明,SA、AsA和NaCl引发小麦种子,可通过上调抗氧化防御和乙二醛酶系统来提高小麦种子干旱耐受性,从而保证更好的幼苗建成。Akash等[32]研究发现,壳聚糖处理可改善绿豆幼苗的基本形态和生理特性,从而缓解不同水势水平对绿豆种子的不利影响。本研究发现,5% PEG处理对干旱胁迫下华北白前种子萌发和幼苗生长产生抑制作用,对鹅绒藤的萌发无显著影响,但抑制了其根和芽的生长,可能是干旱叠加超出了植物耐受范围,从而不能有效发挥其引发价值。其余引发剂均能在不同程度上缓解干旱胁迫对3种鹅绒藤属植物种子萌发和幼苗生长的抑制,其中以0.3% H2O2的缓解效果最佳。H2O2可以通过激活干旱胁迫下植物体内的细胞保护酶系统来抵制过多ROS对机体的伤害[33],但H2O2具有浓度效应,低浓度会促进种子萌发及幼苗生长,高浓度H2O2浸种会腐蚀种皮,减弱其通透性,最终抑制种子萌发和植株生长[34]。故此,在生产中应根据植物种类选择适宜引发浓度,发挥其最大引发价值。由于本试验于室内完成,与自然生境存在较大差异,故引发剂对干旱逆境下野外栽培植物生长发育、产量和品质的影响还需深入研究。
适宜的引发剂能显著促进3种鹅绒藤属植物种子萌发和幼苗生长,对地梢瓜和华北白前种子萌发促进效应最优的3种引发剂分别为H2O、0.3% H2O2和5% PEG,于鹅绒藤而言,最优的引发剂为0.5% KMnO4、0.3% H2O2和5% PEG。此外,适宜的引发剂处理能缓解干旱胁迫所导致的种子萌发受限,其中以0.3% H2O2的效果最佳,可将其作为实践生产中的有效引发剂,具有广阔应用前景。
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