李彩多, 曾晔, 石艳萍, 张迎春, 吴建伟, 陈峥宏, 王涛*
(1．贵州医科大学 基础医学院, 贵州 贵阳 550025; 2．贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室, 贵州 贵阳 550025)
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是生物先天免疫系统中抵抗病原微生物感染的小分子功能多肽[1]。AMPs因其高效地抑制真菌、细菌及病毒等病原微生物的特性,以及不易引起病原微生物产生耐药性等优点,在感染性疾病治疗领域备受瞩目,有望成为传统抗生素的有力替代品[2-6]。因此,深入探究AMPs的作用机理,对于揭示其生物特性、研发新型抗菌药物具有至关重要的意义。研究表明,AMPs不仅对细胞壁和细胞膜产生影响,还可能对细胞内部的细胞器和功能分子产生影响[7-11]。
AMPs来源丰富,不同种类的AMPs作用机制也不尽相同,家蝇抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A,MAF-1A)突变体-22S3(mutant-22S3 of MAF-1A,Mt-22S3)是本课题组对发现的MAF-1A进行构效优化后所获得的新型AMPs分子,前期研究表明,其模板肽MAF-1A可通过作用于白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)细胞内结构来发挥抗C.albicans效果[11],但Mt-22S3是否能影响C.albicans细胞内部结构和功能分子尚不清楚。因此,本研究深入探究Mt-22S3在C.albicans细胞内的作用机制,为AMPs的开发和利用提供理论基础和实验数据。
1.1 实验材料
1.1.1AMPsMt-22S3 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,FMOC)固相法制备多肽(批次为P27963),并经过反相高效液相色谱纯化谱 、液相色谱-质谱技术进行测试,多肽纯度为98%以上。
1.1.2实验菌株C.albicansATCC10231由贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室提供。
1.1.3主要试剂及仪器 沙氏葡萄糖琼脂培养基(sabouraud dextrose agar,SDA)和肉汤培养基(sabouraud dextrose broth,SDB;杭州百思),活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒、线粒体膜电位测定试剂盒、异硫氰酸荧光素-膜联蛋白/碘化丙啶 (fluoresceine isothiocyanate-annexin-V/propidium iodide,FITC-Annexin-V/PI)细胞凋亡检测试剂盒及真菌DNA提取试剂盒(北京Solarbio);正置荧光显微镜(日本尼康ci-e-ds-r11),荧光多功能酶标仪(中国SYNERGY),凝胶成像系统(美国IQuant400)。
1.2 研究方法
1.2.1菌株的活化及菌悬液配制 采用分区划线法将-80 ℃冻存的C.albicans接种于SDA平板,37 ℃温箱中培养;无菌操作下挑取对数生长期C.albicans菌落置于SDB中,以细胞计数法配制菌悬液。
1.2.2Mt-22S3对C.albicans细胞内ROS影响的检测 取对数生长期的C.albicans菌悬液,与终浓度为0、125、250及500 mg/L Mt-22S3作用后,放置于37 ℃温箱培养12 h,4 000 r/min离心5 min,获取C.albicans菌体,经无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS;pH=7.4)洗涤3次,弃上清液,保留菌体沉淀物。按试剂盒方法,加2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)于37 ℃培养箱中避光染色30 min,PBS缓冲液(pH=7.4)洗涤并重悬,使用正置荧光显微镜拍照和记录结果,荧光多功能酶标仪于488 nm激发光、525 nm发射光下检测荧光强度。
1.2.3Mt-22S3对C.albicans线粒体膜电位作用的检测 取对数生长期的C.albicans菌悬液,与终浓度为0、125、250及500 mg/L Mt-22S3作用,同时设氧化磷酸化解偶联剂(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,cccp)作为阳性对照,放置于37 ℃温箱培养12 h,4 000 r/min离心5 min,获取C.albicans菌体,经染色工作液洗涤3次,弃上清液,保留菌体沉淀物。按试剂盒方法加染色工作液,37 ℃培养箱中避光染色20 min,染色缓冲液洗涤并重悬3次。采用多功能酶标仪检测荧光强度,设置485 nm激发波长,将发射波长从525 nm(绿光、FL1)转换为590 nm(红光、FL2),并通过计算荧光比值判断线粒体膜电位变化。
1.2.4Mt-22S3对C.albicans细胞凋亡的影响 取对数生长期的C.albicans菌悬液,与终浓度为0、125、250及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃温箱培养12 h,4 000 r/min离心5 min,获取C.albicans菌体,经无菌PBS洗涤3次,弃上清液,保留菌体沉淀物。依照试剂盒方法作FITC-Annexin-V/PI 染色,通过正置荧光显微镜观察并记录结果。
1.2.5Mt-22S3对C.albicansDNA条带迁移率的影响 按“1.2.1”中方法培养的对数生长期C.albicans,依据真菌DNA提取试剂盒方法提取DNA并检测其纯度。将C.albicansDNA分别与终浓度为0、125、250、500 mg/L AMPsMt-22S3混合,于37 ℃培养箱培养3 h取出。将各组样品与6×Loading Dye混合均匀后进行琼脂糖凝胶电泳,并运用凝胶成像分析仪观察和记录结果。
1.3 统计学分析
2.1 细胞内ROS含量
荧光显微镜下可见,125 mg/L Mt-22S3处理12 h后,C.albicans细胞内开始产生绿色荧光,即出现ROS累积现象;Mt-22S3浓度增加时,出现绿色荧光的C.albicans细胞数大量增加(图1A)。多功能酶标仪检测结果显示,随着Mt-22S3浓度逐渐升高,C.albicans细胞的平均荧光强度逐渐增高;当Mt-22S3浓度达250 mg/L、500 mg/L时,C.albicans细胞的平均荧光强度较0 mg/L Mt-22S3组升高(P<0.05或P<0.01,图1 B)。
注：A为荧光显微镜下ROS的表达(1 000×),B为ROS的定量表达;(1)与0 mg/L Mt-22S3组比较,(1)P<0.05, (2)P<0.01。
2.2 线粒体膜电位
结果显示,与0 mg/L Mt-22S3组比较,阳性对照cccp作用于C.albicans后,可见菌细胞线粒体的FL2∶FL1的比值明显减小,线粒体膜电位降低(P<0.000 1);125、250及500 mg/L Mt-22S3作用C.albicans后,均可以导致菌细胞线粒体的荧光比值较0 mg/L Mt-22S3组明显减小(P<0.01),且随着Mt-22S3浓度的升高,菌细胞线粒体荧光比值随之减小,线粒体膜电位降低越明显(图2)。
2.3 细胞凋亡
荧光显微镜下可见(图3),125、250及500 mg/L AMPsMt-22S3作用于C.albicans后,菌细胞均可出现带有红色荧光的坏死菌细胞和带有绿色荧光的凋亡菌细胞,且随着Mt-22S3浓度的增高,出现红色或绿色荧光C.albicans细胞不断增多,呈剂量依赖性。
注：红、绿及黄色荧光分别表示坏死、早期凋亡及晚期凋亡菌细胞。
2.4 Mt-22S3对DNA的影响
当C.albicans的DNA与250及500 mg/L Mt-22S3作用3 h 后,相较于0 mg/L Mt-22S3组,出现了明显的凝胶阻滞现象,导致大量C.albicansDNA被阻塞在凝胶加样孔附近,同时DNA电泳条带呈现出不同程度的变暗;此外,随着AMPs Mt-22S3浓度的增加,DNA条带的亮度也逐渐减弱。见图4。
注：1～4表示Mt-22S3浓度依次为 0、125、250及500 mg/L。
ROS是在细胞在代谢过程中自然生成的具有化学活性的含氧分子,正常生理条件下在细胞信号传递和体内平衡中起着重要作用[12]。但是各种环境压力可导致ROS增加,从而对细胞造成严重的破坏。有研究显示,过量ROS可通过破坏多种细胞功能分子(包括核酸、蛋白质及脂质)、增加细胞膜通透性等方式导致细胞死亡[13]。有研究表明,诱导ROS的产生是抗真菌药物的一种普遍作用方式,有助于抗真菌药物杀伤病原微生物[14-17]。不同的抗真菌药物,包括咪康唑、两性霉素B可以促使细胞内ROS含量增加来杀灭C.albicans[14-15]。有研究表明,AMPs可以影响线粒体氧化还原平衡,诱导ROS的产生和积累,而ROS的积累则会导致C.albicans的死亡[16-17]。Seyedjavadi等[16]研究表明,高浓度AMPs MCh-AMP1作用C.albicans细胞后,菌细胞内可产生大量ROS,表明MCh-AMP1可通过诱导ROS的产生,导致细胞内氧化损伤。本研究结果显示,250 mg/L、500 mg/L Mt-22S3作用后,染上绿色荧光的C.albicans细胞明显增多,荧光强度增高(P<0.05),提示经Mt-22S3作用的C.albicans细胞内ROS大量增加,表明一定浓度的Mt-22S3也能诱导C.albicans细胞产生大量ROS,提示Mt-22S3可通过诱导细胞内ROS的产生而发挥抗C.albicans作用。
线粒体是能量代谢的重要细胞器,而能量代谢又与细胞生理学和完整性密切相关。研究表明,细胞内ROS的产生和积累能引发细胞线粒体膜电位去极化,导致线粒体功能障碍[18]。此外,大量的ROS会对线粒体的结构组成造成严重损害,进而影响线粒体膜的完整性。文献报道,某些AMPs可以使C.albicans细胞内大量产生ROS,引起线粒体膜电位去极化,使线粒体膜完整性破坏,从而导致线粒体失去其正常的生物学功能[19]。本研究中,使用荧光染料检测C.albicans细胞内线粒体膜电位的变化,结果表明,经过不同浓度的Mt-22S3作用后,C.albicans细胞内线粒体膜电位呈现逐渐降低的趋势,Mt-22S3作用浓度越高,C.albicans细胞内线粒体膜电位去极化越明显(P<0.01),上述结果表明,Mt-22S3可以使线粒体膜电位降低,引起线粒体的去极化现象,进而对线粒体的正常功能造成损害。
近年来研究表明,ROS是细胞凋亡的关键调节因子,ROS的产生是凋亡途径启动相关的早期因素之一,高水平的ROS会使线粒体膜去极化,而线粒体膜的去极化在细胞凋亡中起着重要作用[18-20]。Chen等[21]研究显示,AMPs hep25诱导C.albicans细胞内产生ROS,使线粒体膜电位降低,导致线粒体膜电位去极化,最后诱导C.albicans凋亡;Ma等[22]发现AMP-17导致ROS水平增加、线粒体膜电位的去极化及细胞周期的变化,最终导致C.albicans细胞凋亡和坏死。正常情况下,磷脂酰丝氨酸分布于细胞膜内侧,即与细胞质相邻的一侧,当细菌处于凋亡初期时,这些磷脂酰丝氨酸会被翻转到细菌膜外[22];Annexin Ⅴ属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,可以特异性结合凋亡细胞中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸,在激发光作用下,与凋亡细胞磷脂酰丝氨酸结合的Annexin Ⅴ-FITC可使细胞出现绿色荧光[22]。PI是一种荧光核酸染料,不能穿透完好无损的细胞膜,可透过破损的细胞膜进入坏死的细胞内,使细胞产生红色荧光[23]。本研究中,Mt-22S3作用于C.albicans细胞后可促使菌细胞产生绿色或红色荧光,表明Mt-22S3不仅可以使C.albicans细胞磷脂酰丝氨酸外翻,还能破坏细胞膜完整性,增加细胞膜通透性,从而提示Mt-22S3可以使C.albicans细胞产生细胞凋亡和细胞坏死现象。念珠菌中的细胞凋亡主要通过2条途径发生,第一种是半胱氨酸蛋白酶依赖性途径,第二种是半胱氨酸蛋白酶非依赖性途径[19-20]。ROS增加、线粒体功能障碍及钙离子的积累是激活半胱氨酸蛋白酶依赖性途径使细胞凋亡的重要因素。由本研究结果可见,Mt-22S3可以使C.albicans细胞大量产生ROS,引起线粒体膜电位降低,线粒体功能受损,提示Mt-22S3可能通过半胱氨酸蛋白酶依赖性途径诱导C.albicans发生细胞凋亡。
有研究显示,某些AMPs进入菌体细胞内可通过静电结合等方式与菌细胞DNA结合,导致菌细胞的正常生理功能受阻,从而发挥其抗菌活性[24]。有研究表明,琼脂糖凝胶阻滞实验的电泳迁移率可用于评估AMPs与菌细胞DNA之间的结合情况[11,25]。当AMPs与C.albicans的DNA分子结合时,其所形成的结合物在电泳中的迁移率将受到抑制,导致其出现滞后于单独存在的DNA分子[11,25]。本研究凝胶电泳结果显示,相较于阴性对照,与Mt-22S3共孵育的DNA出现显著的凝胶阻滞现象,大量C.albicans的DNA 被阻止并停滞在凝胶加样孔附近,结果表明Mt-22S3进入细胞后与C.albicans细胞的DNA分子发生了结合作用,从而阻挠DNA的复制等生理功能,最终发挥了抗C.albicans的效果。
综上所述,Mt-22S3进入C.albicans细胞内后,可通过诱导胞内产生大量ROS、去极化线粒体、诱导凋亡、与DNA分子结合等方式破坏C.albicans细胞的正常生理机能,发挥抗C.albicans作用。
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