张琪，李鹤楠，王临江，刘丹，王婧，蔡德富
齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江齐齐哈尔 161006
肿瘤是威胁人类生命健康的第二大疾病，也是阻碍人类预期寿命提高的主要原因之一。尽管已经对肿瘤研究做出了长时间的努力，但化疗仍然是多种肿瘤的主要治疗方法。且严重的不良反应和长期的耐药性限制了化疗的临床应用。因此，临床上迫切需要开发新的抗肿瘤药物。中药是中华民族的巨大财富，是多种潜在抗肿瘤候选药物的丰富来源，为寻找有效性强且毒性小的治疗药物，越来越多的研究者开始将视线转向中药。和厚朴酚（Honokiol, HNK）是从中药厚朴中提取得到的小分子双酚木质素类化合物，是厚朴的主要活性成分之一，其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抑制血管生成、抗痉挛、抗抑郁、抗病毒和抗肿瘤等广泛的药理作用。特别是关于HNK抗肿瘤作用及相关机制的研究报道在逐渐增加。本文就近年国内外HNK的抗肿瘤作用及相关机制进行总结分析，以期为HNK的进一步新药开发和临床应用提供一定参考。
多项研究表明HNK可在肿瘤发生、发展进程中关键节点包括肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、血管生成和肿瘤免疫原性中发挥作用。与靶向抗肿瘤药物不同，HNK具有多靶点、并通过作用于多条信号通路产生抗肿瘤作用。
1.1 诱导凋亡和抑制增殖
程序性细胞死亡或凋亡是一种进化上保守且高度受控的细胞死亡形式，对多细胞生物的稳态和发育至关重要。多项在不同癌症细胞系和动物模型的临床前研究表明，HNK可以增强促凋亡蛋白的表达如Bcl-2相关X蛋白（Bax）、BH3相互作用结构域死亡激动剂（Bid）和Bcl-2同源拮抗剂/杀伤剂（Bak），并减少抗凋亡蛋白如B细胞淋巴瘤的表达蛋白-2（Bcl-2）和Bcl-xL。另外，HNK还可以触发释放线粒体细胞色素c进入胞质并激活caspase级联反应，进而在凋亡介导的肿瘤细胞死亡与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶裂解中发挥重要作用。
有研究表明，HNK对人膀胱移行肿瘤细胞BFTC-905具有显著的抗增殖作用。此外，HNK在低剂量下可以诱导G0/G1期细胞周期停滞，而在高剂量下显著诱导细胞凋亡。此外，在HNK处理的细胞中发现了活性氧的显著积累并且诱导肿瘤细胞线粒体膜超极化。同时，在大剂量HNK处理的膀胱肿瘤细胞中发现caspase-3/7被激活。这些结果表明HNK可以通过干预线粒体途径诱导膀胱肿瘤细胞凋亡[1]。未来在治疗膀胱肿瘤方面，HNK可能具有潜在的临床应用价值。也有研究表明HNK能明显抑制乳腺癌4T1细胞增殖，且随时间增加，抑制作用也相应地增强。其作用机制可能是通过上调凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3的表达来诱导乳腺肿瘤细胞凋亡。同时，体内研究结果表明HNK可显著延长小鼠乳腺癌细胞4T1肺转移Balb/c小鼠模型生存期[2]。Lou GG等[3]研究发现HNK以剂量依赖的方式诱导膀胱肿瘤细胞T24凋亡，HNK与羟基喜树碱组凋亡更加明显。进一步的机制研究表明HNK诱导凋亡主要是通过激活Caspase通路和抑制NF-κB、Akt和ERK蛋白磷酸化进行。
1.2 阻滞细胞周期
细胞周期涉及DNA复制、细胞器和细胞质分裂等一系列过程，多种蛋白参与细胞周期的进展，是细胞生长和分裂中的一个高度组织和调节过程[4]。有研究显示，在体外HNK可浓度和时间依赖性抑制Hep3B肝癌细胞生长，但相同浓度或者时间下，HNK对正常肝细胞毒性相对较小。进一步研究显示，HNK可能是通过诱导Hep3B细胞周期G1/S阻滞，从而抑制肝癌细胞的增殖。小鼠皮下移植肿瘤模型结果表明，HNK可显著抑制肿瘤生长，机制研究发现HNK给药后，Hep3B细胞周期蛋白Cyclin D1表达显著降低，而细胞周期负调控蛋白P53、P27、P21表达均不同程度升高[5]。HNK可以通过调节细胞周期调节蛋白如cyclin、CDKs及CDKi等引起细胞周期阻滞。采用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色法和流式细胞术检测HNK给药处理48 h的H4人神经胶质瘤细胞周期，发现HNK给药组S期和G2/M期H4细胞百分比明显增多。Western-blot结果进一步证明HNK给药处理后可以显著抑制H4人神经胶质瘤细胞中细胞周期相关蛋白Cyclin B1、CDC2和cdc25蛋白的表达，而上调p-CDC2和pcdc25c的表达[6]。另外，将PC-3前列腺癌症细胞暴露一定剂量的HNK后，c-Myc蛋白总量和/或磷酸化蛋白水平及其mRNA表达显著降低。HNK处理进一步降低了c-Myc下游靶标包括细胞周期蛋白Cyclin D1和Zeste同源增强子2（EZH2）的表达，进而将PC-3细胞更多地阻滞在G0/G1期[7]。Wang J等[8]构建了基于莱苞迪苷A（Rebaudioside A, RA）的新型纳米胶束用于递送HNK，发现RA-HNK纳米胶束可以增强HNK的体内外抗肿瘤活性，游离HNK和RA-HK纳米胶束都能够将HuH-7细胞更多地阻滞在G0/G1期，初步机制研究表明，游离HNK和RA-HNK纳米胶束可以抑制周期相关蛋白cyclin D1和CDK4的表达。RA-HNK纳米胶束组对G0/G1期细胞百分数、周期相关蛋白的表达量等的效果要远好于游离HNK，这说明RA-HNK纳米胶束可以提高HNK的体外生物活性。
1.3 诱导自噬
自噬是一种严格调节的溶酶体系统，细胞吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，是众所周知的Ⅱ型程序性细胞死亡（Programed Cell Death, PCD）。自噬在癌症细胞干性维持以及诱导癌症复发过程发挥关键作用。多项研究发现HNK不仅可以通过激活凋亡途径引导癌症细胞死亡，也可通过诱导自噬的途径显著诱导癌症细胞死亡。罗敏等[9]的研究显示HNK可诱导人非小细胞肺癌细胞A549的G1期阻滞和凋亡，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可减弱这种作用。进一步机制研究显示HNK可以增加腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase,AMPK）磷酸化水平并抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin, mTOR）的磷酸化水平，以上结果提示HNK主要依赖于AMPKmTOR信号通路诱导的自噬促进非小细胞肺癌细胞凋亡。也有研究显示经HNK处理后，可以诱导PC-3、LNCaP和Myc-CaP三种细胞显现明显的保护性自噬。与对照组肿瘤相比，来自HNK处理的小鼠PC-3异种移植肿瘤含有更高水平的LC3BII蛋白。而使用3-甲基腺嘌呤以及自噬调节因子重组人自体吞噬相关蛋白5（Recombinant Human Autophagy Related 5, ATG5）的RNA干扰对自噬进行抑制，显著增强了HNK暴露引起的细胞活力抑制和凋亡诱导。
HNK介导的LC3BII蛋白水平的增加在抗氧化剂的存在下又显著减少。这表明HNK能够提高前列腺癌细胞的保护性自噬[10]。Mottaghi S等[11]发现HNK能够引起剂量和时间依赖性的人骨肉瘤细胞死亡。HNK诱导的细胞死亡类型主要为自噬和细胞凋亡。细胞内活性氧的产生、促分裂原活化蛋白激酶的激活和Atg7的上调对HNK诱导骨肉瘤细胞发生自噬起关键作用。这些结果表明，HNK通过活性氧/细胞外信号调节激酶1/2信号通路在人骨肉瘤细胞中引起G0/G1期阻滞、诱导细胞自噬和凋亡。Sabarwal A等[12]的最新研究结果显示，HNK与雷帕霉素联合治疗有很大的潜力限制移植受者和其他免疫抑制患者的肾肿瘤生长。这种联合可显著诱导肾肿瘤细胞的自噬和凋亡，促进癌症细胞死亡。而这些主要是通过升高自噬相关蛋白Carabin和降低自噬抑制蛋白Rubicon来实现，并且与肿瘤促进受体酪氨酸激酶AXL的表达减少有关。
1.4 抑制上皮－间质转化
上皮－间充质转化（Epithelial Mesenchymal Transition, EMT）是发育过程中上皮细胞获得侵袭性间充质细胞特征的一个复杂而关键的过程。EMT被发现与癌症的侵袭和转移密切相关，被认为是促进肿瘤细胞迁移和侵袭的重要因素。EMT的主要特征是上调间充质标志物N-cadherin蛋白，随后上皮表面标志物E-cadherin蛋白下调。在EMT过程中E-cadherin蛋白的下调主要是通过EMT转录因子例如TWIST、SNAIL和SLUG与E-cadherin蛋白启动子结合介导的转录抑制所引起[11]。研究发现，通过将不同浓度的和厚朴酚（0、10、20、40 μM）处理PC3细胞48 h，可显著抑制细胞迁移与侵袭能力。Western-bloting结果进一步提示HNK处理非小细胞肺癌可显著降低N-cadherin，vimentin及β-catenin蛋白的表达，E-cadherin蛋白表达量则显著升高。mRNA检测结果显示β-catenin及基质金属蛋白酶9的相对mRNA表达量显著降低。这表明HNK可以通过靶向调控Wnt/β-catenin在体外抑制EMT介导的前列腺癌PC3细胞的运动和迁移，而HNK可成为潜在的抗肺癌转移药物或先导化合物[13]。HNK还可以通过调节β-catenin/MITF轴促使Calpain-10和CHOP/GADD153调节的级联反应显著抑制高度转移性黑色素瘤的进展。研究认为HNK通过内质网应激激活和EMT标志物抑制，可以有效减少黑色素瘤腹膜播散和器官转移[14]。Wang WD等[15]的研究发现HNK（10-70 μmol/L）能以剂量依赖性方式抑制人乳腺肿瘤细胞系MCF7、MDA-MB-231和小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1的生存能力。在transwell和划痕迁移实验中，HNK剂量依赖性地抑制乳腺癌症细胞的侵袭和迁移。证明HNK（10-50 μmol/L）剂量依赖性上调乳腺癌症细胞蛋白质水平的上皮标记物E-cadherin，下调间充质标记物如Snail和Vimentin等。通过嘌呤霉素掺入试验发现HNK降低了乳腺肿瘤细胞中Snail的翻译效率。在肿瘤转移的小鼠模型中，腹膜内给予HNK[50 mg/（kg·d），6次/周，持续30 d]显著减少了转移性4T1细胞衍生结节的数量，并改善了肺部的组织学改变。此外，HNK治疗的小鼠在转移性结节中表现出Snail表达降低和E-cadherin蛋白表达增加。
1.5 激活内质网应激
内质网应激也称为未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Sesponse, UPR），是一种由于错误折叠和未折叠蛋白的积累而发生的细胞状况。Zhu JF等[16]的研究表明HNK能够以剂量和时间依赖的方式显著降低人肺癌A549和95-D细胞的活力。显著上调内质网应激诱导的凋亡信号分子像GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、Bcl-2、Bax和Caspase9的表达。这些结果表明HNK对A549和95-D细胞中的抗癌活性至少部分是通过内质网应激信号通路介导的。有研究表明HNK通过与GRP78 ATP酶结构域的未折叠构象结合，进而诱导6种神经外胚层肿瘤细胞系死亡。而且HNK诱导凋亡的效果是表没食子儿茶素没食子酸酯的两倍。同时，HNK与内质网应激诱导剂芬瑞汀或硼替佐米联合用药对黑色素瘤和胶质母细胞瘤细胞具有协同作用，但对神经母细胞瘤的细胞仅具有相加作用（芬瑞汀）或抑制作用（硼替佐米）。结果表明HNK可作为一种候选抗肿瘤药物值得进一步研究开发[17]。Chiu CS等[14]也研究发现可以利用HNK诱导的ER应激激活CHOP，进而抑制MITF和β-catenin途径实现抑制黑色素瘤的生长和转移。
1.6 抑制肿瘤细胞迁移
HNK能够调节肿瘤转移关键信号通路包括基质金属蛋白酶9、信号转导因子和转录激活因子3及其下游分子，显著降低肿瘤细胞的转移能力[15]。迁移和侵袭是转移的关键步骤，而细胞运动性降低意味着肿瘤细胞从原发位置转移到远端的机会减少。多项研究证实HNK对多种类型肿瘤细胞具有抑制迁移和侵袭的能力。伤口愈合和Transwell小室的实验研究也表明HNK及其纳米制剂能够显著抑制乳腺癌4T1细胞的侵袭和迁移。进一步的动物实验也证明HNK能够抑制乳腺癌肺和肝的转移，显著提高了乳腺癌的治疗效果[18-19]。也有研究发现HNK能够降低M2标记物如CD206、Arg1和CCL2的表达，显著抑制M2极化巨噬细胞中信号转导子和转录激活子信号转导因子和转录激活因子6和信号转导因子和转录激活因子3的激活。同时，和厚朴酚通过促进信号转导因子和转录激活因子1磷酸化增加M1标记物如CD11c、诱导型一氧化氮合酶和白介素12的表达。此外，HNK还降低了肺组织中M2/M1巨噬细胞的比例和白介素-10/白介素-12基因的表达，从而抑制了小鼠乳腺癌症的增殖和肺部转移。HNK还可以通过调控趋化因子配体2/趋化因子C-C-基元受体2途径减少巨噬细胞对肺组织的浸润。表明HNK具备通过调节巨噬细胞的极化和募集来抑制乳腺癌进展和肺转移的潜力[20]。HNK还会进一步影响表细胞黏附分子的表达，HNK剂量依赖性地抑制肿瘤坏死因子－α刺激的人脐静脉内皮细胞HUVECs中细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1的表达，从而抑制肿瘤细胞黏附以及之后的侵入周围组织或脉管系统，最终阻止肿瘤细胞的转移[21]。
1.7 诱导活性氧生成
活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是指在生物体内与氧代谢有关的、含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称。在机体内，ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，在线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给氧气的过程中，有一部分氧气被还原，形成O2-或过氧化氢。ROS形成氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用[22]。众所周知，ROS在细胞内信号通路的调节中起着重要作用，过量的ROS产生会导致细胞凋亡[23]。HNK具有诱导膀胱肿瘤细胞BFTC-905的ROS依赖性凋亡的潜力。其可导致ROS的显著积累以及膀胱癌症细胞中基质金属蛋白酶的下调，进而诱导线粒体膜超极化导致线粒体功能障碍，导致caspase-3和caspase-7的激活通过线粒体途径诱导膀胱肿瘤细胞凋亡[24]。Li SL等[25]的研究显示装载HNK的脂质体能够增加人髓母细胞瘤D283细胞和DAOY细胞的ROS产生，而该作用可被ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸阻断。进一步的研究提示细胞内ROS的增加主要是由抑制ERK/p38-MAPK信号通路所引起。该发现表明HNK脂质体可以克服其水溶性差、生物利用度低的缺点，可作为髓母细胞瘤的新型治疗候选药物。
到目前为止，多个文献已经证实HNK具有强大的药理活性，在体外和体内对各种类型肿瘤显示出良好的治疗作用。然而，HNK的确切抗肿瘤机制尚未被完全阐明，特别是在临床与人类肿瘤相关的机制。同时，由于HNK水溶性差、广泛的首过代谢和低吸收，HNK的口服生物利用度较差。因此，HNK的生物利用度需要改进以促进其临床进一步的使用。到目前为止，多个研究团队开展利用脂质体、纳米粒等纳米载体改善HNK的溶解度、提高生物利用度和抗肿瘤活性的尝试，取得了良好的效果。然而，还需要进行更深入和系统的研究来探索更有效的纳米递送系统，以提高HNK的生物利用度和抗肿瘤活性。另外，由于HNK在体内被代谢为不同的代谢产物，为了更好地了解HNK给药后的体内去向，识别体内循环的不同类型的代谢产物显得至关重要。而与HNK相关的体内代谢研究、人类有效治疗剂量的临床转化研究还不完善，缺乏HNK的不良反应和安全性数据的毒理学研究，缺乏HNK对免疫系统影响以及与其他细胞毒性药物或常规化疗药物相互作用的研究。以上相关研究的缺失限制了HNK作为一线抗肿瘤药物的临床使用。加强上述与HNK相关的作用机制、代谢、安全性及纳米制剂的研究，将HNK开发为一种疗效显著、安全性高并且抗肿瘤机制明晰的临床新药应该成为医药工作者未来的首要任务。
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