梁月仪,吕渭升,黄 爽,杨 洁,侯栩轩,陈志鹏,夏天睿,何广铭
广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室,佛山 528244
梅在我国的栽培历史深远悠久,品种复杂繁多,为多年生小乔木或灌木,其花和果实等部位均可作药用。梅花为我国传统花类药材之一,据《本草纲目》记载:梅花性平,微酸,归肝、胃、肺经,收载于《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》),来源为蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花蕾[1]。具有疏肝和中、化痰散结的功效,常用于治疗梅核气,肝胃气痛、郁闷心烦,食欲不佳,瘰疬疮毒。梅在我国各地区均有栽培,而药用梅花的道地产区主要为江苏、浙江、安徽等地[2]。
目前已有约上百种化学成分可从梅花中分离得出,主要为挥发性成分、黄酮类、酚酸类、酰化类产物、酚苷类成分和醇苷类成分;其中酚酸类及黄酮类成分具有多方面药理活性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抑制黑色素生成等,是梅花药理活性的主要物质基础[3]。现行版《中国药典》规定的含量测定指标有绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷三种成分,Zheng等[4]则以梅花中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素共6种成分的含量进行质量控制,但对其他黄酮类成分的含量尚未见报道,目前针对梅花的质量控制研究仍较为匮乏。
鉴于酚酸类、黄酮类均为梅花发挥药效的基础物质,本研究基于对文献的调查,分别选取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸3种酚酸类代表性成分和金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷6种黄酮类代表性成分[5]作为质量控制指标,建立了同时测定梅花药材中9个指标成分UPLC含量测定方法,收集45批梅花药材,分为花蕾期、盛花期、末花期3类样品进行测定,并对其化学成分含量的差异进行比较分析[3]。
因梅花化学成分较复杂,难以通过单一成分变化对药材质量作出评价,而本研究中可通过同时测定多类活性成分反映不同时期含量变化而推测质量变化趋势。根据历代本草中记载,梅花含苞未放者与花开者质量存在差异,但目前暂未有深入报道对不同生长期的质量研究。故对梅花不同花期的质量进行对比研究,对确定梅花的采收期有重要意义。
1.1 仪器
超高效液相色谱仪(H-class,美国沃特世公司);Waters BEH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)色谱柱;百万分之一天平(XP26型,瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.2 试剂和对照品
分析级乙醇和甲醇均购自西陇科学股份有限公司,液相用磷酸、甲醇和乙腈均购自默克股份有限公司,水为超纯水,由实验室自制。
绿原酸(批号:110753-202119,含量:96.3%)、新绿原酸(批号:DSTDX001504,含量:98.0%)、隐绿原酸(批号:DST210520-017,含量:98.0%)对照品(乐美天医药科技有限公司);金丝桃苷(批号:111521-201809,含量:94.9%)、异槲皮苷(批号:111809-201804,含量:97.2%)、水仙苷(批号:111997-201501,含量:93.10%)、芦丁(批号:100080-201811,含量:91.7%)对照品(中国食品药品检定研究院);槲皮素-3-O-新橙皮苷(批号:CFS202002,含量:98.0%)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(批号:CFS202102,含量:98.0%)对照品(Chem Faces公司)。
1.3 药材
实验所用梅花药材均由广东一方制药有限公司采购管理部于产地采集,经广东一方制药有限公司质量中心检定合格,均符合2020年版《中华人民共和国药典》(一部)“梅花”药材项下规定,且经孙冬梅主任中药师鉴定为蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花,药材产地信息详见表1,包括花蕾期(bud stage,BS)、盛花期(blooming period,BP)、末花期(final flowering period,FP)3类样品。
表1 梅花样品信息
2.1 色谱条件
选择Waters BEH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)色谱柱;以甲醇-乙腈(6∶1)为流动相A,0.3%磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱(0～10 min,13%A;10～11 min,13%→20%A;11～30 min,20%A;30～43 min,20%→28%A;43～53 min,28%→35%A),流速为0.25 mL/min;柱温为45 ℃;检测波长为355 nm;进样量1 μL。
2.2 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和水仙苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含绿原酸140 μg、其他成分各含20 μg的混合溶液,即得。
2.2.2 供试品溶液的制备
取不同花期的梅花药材粉末(粉碎:过筛用药筛筛号为四号筛,目数为65目,筛孔内径为250 μm±9.9 μm)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入10%甲醇50 mL,称定重量,加热回流30 min,取出,放冷,再称定重量,用10%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适应性试验
按照“2.1”项下色谱条件测定混合对照品溶液、梅花样品(FP14)供试品溶液和空白溶剂,结果表明样品中各成分分离度与响应值均较好,且空白样品溶液无干扰(见图1)。
图1 梅花药材中9个成分含量专属性考察图Fig.1 Specificity investigation of nine components in Mume Flos
2.3.2 线性试验
精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和水仙苷对照品适量,制成每1 mL含新绿原酸809.382 μg、绿原酸1 392.113 μg、隐绿原酸10.408 μg、槲皮素-3-O-新橙皮苷110.054 μg、金丝桃苷558.866 μg、异槲皮苷768.074 μg、芦丁390.459 μg、山柰酚-3-O-芸香糖苷112.896 μg和水仙苷110.510 μg的混合对照品贮备溶液。分别精密移取上述对照品贮备溶液0.5、1.0、1.5、2.5、3.0 mL,分别置5 mL量瓶中,加甲醇制成每1 mL含新绿原酸0.080 9、0.161 9、0.242 8、0.404 7、0.485 6、0.809 4 μg,绿原酸0.139 2、0.278 4、0.417 6、0.696 1、0.835 3、1.392 1 μg,隐绿原酸0.001 0、0.002 1、0.003 1、0.005 2、0.006 2、0.010 4 μg,槲皮素-3-O-新橙皮苷0.011 0、0.022 0、0.033 0、0.055 0、0.066 0、0.110 1 μg,金丝桃苷0.055 9、0.111 8、0.167 7、0.279 4、0.335 3、0.558 9 μg,异槲皮苷0.076 8、0.153 6、0.230 4、0.384 0、0.460 8、0.768 1 μg,芦丁0.039 5、0.078 9、0.118 4、0.197 3、0.236 8、0.394 6 μg,山柰酚-3-O-芸香糖苷0.011 3、0.022 6、0.033 9、0.056 4、0.067 7、0.112 9 μg,水仙苷0.011 1、0.022 1、0.033 2、0.055 3、0.066 3、0.110 5 μg 的混合对照品应用液,依次精密吸取上述混合对照品贮备液和应用液各1 μL,按“2.1”项下色谱条件进样测定,以峰面积(Y)为纵坐标,以对照品浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,结果见表2所示,相关系数r均大于0.999 0,表明各成分在规定的浓度范围内,峰面积与对照品浓度线性关系良好。
表2 各成分线性考察结果
2.3.3 稳定性试验
取同一份梅花样品(FP14),分别于样品制备后的0、2、4、8、12、18、24 h进样,按“2.1”项下色谱条件测定,结果梅花样品溶液中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积RSD值分别为2.0%、2.7%、3.0%、1.8%、2.7%、2.8%、2.0%、1.4%、0.46%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.4 重复性试验
取同一份梅花样品(FP14)约0.5 g,精密称定,按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份,按“2.1”项下色谱条件测定,结果梅花样品溶液中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的RSD值分别为0.24%、0.45%、2.6%、2.8%、0.76%、2.5%、1.8%、1.7%、2.0%,表明重复性良好。
2.3.5 加样回收试验
分别称取6份已知含量的梅花样品(FP14)约0.25 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,分别加入一定量的绿原酸、异槲皮苷、芦丁、新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-新橙皮苷、水仙苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,测定溶液中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和水仙苷含量并计算加样回收率,结果见表3所示,均符合规定,表明该分析方法准确度良好。
表3 各成分加样回收率测定结果
2.4 样品测定
取45批各花期的梅花药材粉末,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,采用外标法进行计算,45批梅花药材中9个成分含量测定数据结果见表4。结果显示45批梅花药材中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、槲皮素-3-O-新橙皮苷、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和水仙苷含量范围分别为0.410%～1.29%、4.83%～7.66%、0.005%～0.066%、0.185%～0.508%、0.259%～0.859%、0.387%～1.18%、0.606%～1.52%、0.042%～0.127%、0.140%～0.334%,不同花期9个指标成分含量的均值对比见图2。
图2 不同花期梅花药材9个指标成分含量均值占比图Fig.2 The average proportion of nine index components in different flowering stages of Mume Flos
表4 含量测定结果
2.5 化学模式识别分析
化学计量学中的模式识别技术已广泛应用于中药材产地、基原、炮制、真伪鉴别等方面[6],分为有、无监督两种统计方法,一般先进行无监督的HCA、PCA,观察样本之间是否有分类趋势,再采用PLS-DA或者OPLS-DA进行有监督的模式识别,显示样本间引起差异主要的变量,从而寻找质量差异性标志物[7]。
2.5.1 聚类分析(HCA)
以45批不同花期梅花样品中9个成分的含量为数据源,利用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行min～max标准化处理,再应用HemI1.0软件以平方欧式距离进行层次聚类,见图3,显示所有45批样品被聚为3类,其中15批花蕾期样品聚为一类,主要特征为绿原酸的含量最高(范围为6.6%～7.6%);11批末花期样品聚为一类,主要特征为新绿原酸的含量最低(0.41%～0.77%);15批盛花期样品以及4批末花期样品大致聚为一类,说明通过聚类分析可大致区分花蕾期与另外两个花期的梅花样品。
图3 不同花期梅花药材中9个指标成分含量的聚类分析图Fig.3 Cluster analysis diagram of nine index components in Mume Flos medicinal materials at different flowering stages
2.5.2 主成分分析(PCA)
为了更好地将各不同花期梅花进行区分,另采用主成分分析(principal component analysis,PCA)进行分析,PCA可实现高维数据的降维处理,少数几个主成分(综合变量)即可代原始数据的大部分信息。同样以45批不同花期梅花药材9个成分含量为原始数据,导入SIMCA14.1软件绘制45批不同花期梅花样品的主成分得分图,生成3个主成分,累积贡献率为0.973,Q2为0.928,Q2大于0.5证明模型有效,以前两个主成分的得分值为X、Y值,生成PCA得分图(见图4)。结果显示,PCA按花期的不同,将45批梅花大致分为三类,其中15批花蕾期梅花(BS1～BS15)为I类,15批盛花期梅花(BP1～BP15)为II类,15批末花期梅花(FP1～FP15)为III类。盛花期和末花期梅花在PCA得分图上分布较为接近,而花蕾期梅花,在主成分得分上与盛花期、末花期梅花的差异较大,说明梅花在花蕾期和开花后化学成分的含量存在较大变化,该结果与聚类分析基本一致。
图4 PCA得分图Fig.4 PCA score diagram
2.5.3 正交偏最小二乘法-判别式分析(OPLS-DA)
为了更好地观察不同花期梅花样品之间的组内差异,进一步采用有监督的OPLS-DA模型进行分析。以样品FP1～FP15、BP1～BP15、BS1～BS15为Y变量,9种成分的含量为X变量,利用SIMCA14.1软件进行OPLS-DA处理。结果在建立的偏最小二乘判别分析模型中R2X(cum)=0.971,R2Y(cum)=0.876,Q2(cum)=0.845,均大于0.5,说明建立的OPLS-DA 模型解释率和预测力可靠、良好,见OPLS-DA得分图5。结果显示45批样品分为3类,3种花期各为一类,更进一步对9个成分含量数据聚类分析结果进行分类,同时表明这9个成分在评价样品花期之间的质量差异具有重要参考价值。同时,结合变量重要性投影值(variable importance in projection,VIP)值越大,表明对样品分类贡献较大;图6其中VIP>1的有3种成分,依次为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸,说明这3种成分是影响不同花期样品之间质量差异贡献较大的成分,均为酚酸类成分,可作为指导梅花药材质量控制的关键成分。
图5 OPLS-DA得分图Fig.5 OPLS-DA score diagram
图6 PLS-DA模型VIP图Fig.6 VIP diagram of PLS-DA model
本研究含量测定结果显示,不同花期梅花药材中新绿原酸、绿原酸等主要酚酸类成分的含量在花蕾期最高,而丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等黄酮类成分的含量则盛花期最高。其中酚酸类成分的含量变化与文献报道的趋势一致[8,9],即由花蕾期到末花期随着花开的阶段绿原酸含量有所降低。因此,造成梅花不同花期差异的主要原因为酚酸类成分的变化。
近年利用中药多成分测定结合化学模式识别分析中药样品的差异,在中药质量评价研究应用中较为广泛[10-14]。本研究通过同时测定45批梅花药材中9个成分含量,并结合化学模式进行分析,探索了鉴别不同花期梅花药材的方法。在HCA分析结果中,3个花期的梅花样品分别聚为3类,其中花蕾期梅花全部聚为一类,末花期梅花样品大部分聚为一类,所有盛花期样品聚为一类,结果表明梅花药材的不同花期成分含量有明显的差异。结合PCA和 PLS-DA 进一步分析了不同花期梅花的质量差异标志物,结果显示,3个花期的梅花样品均明显位于空间的不同位置,反映了梅花样品不同花期间的差异。同时发现新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸3种酚酸类成分是区分不同花期样品贡献较大的差异性成分,这与上述梅花不同花期主要酚酸类成分含量有所差异的结论相符。
综上,本研究建立了梅花药材多个成分的含量测定方法,为梅花药材的质量标准提升提供了重要参考,同时结合化学计量学的分析,揭示了酚酸类成分在梅花不同花期间的差异,对其进行质量控制,有利于反映梅花的质量变化属性。
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