朱玉光，方丽佳，黄素玲（石家庄市中医院检验科，石家庄 050011）
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性关节炎症为主要临床表现的自身免疫病，其基本病理表现为滑膜炎，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失[1]。目前关于RA 的发病机制尚不明确，多认为与自身抗原刺激机体产生自身抗体从而导致机体调节功能紊乱有关，研究发现[2]，RA 患者由于免疫系统功能紊乱，常发生免疫应答，使得机体中产生多种自身特异性抗体，进而引起各种促炎细胞因子的释放，引起关节滑膜慢性炎症、炎症细胞浸润、软骨和骨骼破坏，最终导致关节组织的破坏。早期诊断、达标治疗是控制病情和改善预后的关键，自身抗体对RA 患者的诊断与鉴别诊断以及病情严重程度和预后的判断有着重要作用。类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是RA 中首个检测到的自身抗体，与RA 患者疾病活动度密切相关，阳性率约为70%，但RF 在其它疾病（干燥综合征、血液病等）中均呈现阳性，因此其缺乏特异性[3-4]。抗环瓜氨酸多肽（anticyclic citrulline peptide，anti-CCP）是一类以瓜氨酸类蛋白为靶抗原的自身抗体，是由RA 患者B 淋巴细胞自发分泌，而其他疾病患者和正常人群B 淋巴细胞并不自发分泌CCP，因此认为诊断RA 具有较高的灵敏度和特异度[5-6]。有学者认为CCP 可能作为早期致病靶抗原参与RA 的发病机制，诱导抗原特异性T 细胞的产生并引发一系列自身免疫反应，即在患病早期患者体内可能出现CCP抗原特异性T 淋巴细胞（CCP/AST）[7-8]。基于此，本研究通过检测RA 患者关节滑液及滑膜组织中CCP/AST 表达水平，为探究RA 发病的免疫学机制以及临床治疗提供参考依据。
1.1 研究对象 纳入石家庄市中医院2021年1～12月收治的128 例RA 患者作为RA 组，根据关节功能分类标准将患者分为轻度组（I～II 级，n=46），中度组（III 级，n=52）和重度组（IV 级，n=30）。纳入标准：①所有患者均根据美国风湿病学会标准[9]诊断为RA，严重程度I～IV 级；
②近期无免疫性药物或抗体治疗。排除标准：①其他风湿性疾病；
②严重肝肾功能障碍患者；
③有精神疾病史、妊娠哺乳期患者。选取同时期在石家庄市中医院行关节镜检查的关节疼痛患者50 例作为对照组，其中男性18 例，女性32 例，年龄30～75（53.65±5.43）岁。RA 组患者男性43 例，女性85 例，年龄30～75（55.24±6.19）岁。RA组和对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2/t=0.092，1.592，P=0.761，0.113）。本研究通过伦理委员会的批准，研究对象均提供知情同意书。
1.2 仪器与试剂 胶原酶 A，DNAse（Roche 公司，瑞士）；
Pierce™ BCA 蛋白质检测试剂盒（赛默飞世尔科技公司，美国）；
兔抗人RF 多克隆抗体、兔抗人β-ACTIN 多克隆抗体（Abcam 公司，美国）；
兔抗人ACPA 多克隆抗体（CST 公司，德国）；
辣根过氧化物酶偶联二抗（上海碧云天公司）；
Clarity™ Western ECL Substrate，ChemiDoc™MP 成像系统（BIO-RAD 公司，美国）；
SYBRGREEN 化学实时PCR（海德堡科技公司，德国）；
StepOnePlus™ Real-Time PCR System，ABI 7500 Prism 系统软件（应用生物系统公司，美国）；
BD LSRII 流式细胞仪（BD 公司，美国）。
1.3 方法
1.3.1 样本采集：RA 组及对照组通过超声引导关节镜检查获得滑膜组织和关节滑液，Ficoll-Hypaque 梯度离心制备滑液单核细胞（synovial fluid mononuclear cells，SFMC），将细胞离心收集后，用细胞冻存液重悬，取1ml 细胞至冻存管中，放入冻存盒，将冻存盒置于-80℃冰箱保存备用。
1.3.2 蛋白质印迹分析：使用裂解缓冲液提取滑膜组织中蛋白质并通过Pierce™ 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质检测试剂盒（赛默飞世尔科技公司，美国）进行定量。在每孔细胞中加入200μl 含100mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和1 mol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)的细胞裂解缓冲液RIPA，吹打细胞进行重悬，超声裂解 20～30次，冰上裂解30min，100℃金属浴 5 min，然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳、转膜，5ml/dl 脱脂奶粉进行封闭，孵育一抗[抗RF（Abcam，ab106646；
稀释度1∶1 000），抗ACPA（CST，3598S；
稀释度1∶1 000）和抗 β-ACTIN（Abcam，ab8227；
稀释1∶5 000）]，孵育二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG），电化学发光(electro chemiluminescence，ECL)plus 试剂检测蛋白。用洗膜缓冲液冲洗后，使用Clarity™ Western ECL Substrate（BIO-RAD 公司，美国）进行可视化，使用ChemiDoc™ MP 成像系统（BIO-RAD 公司，美国）进行条带检测。
1.3.3 关节滑液中CCP/AST 表达分析：标记来自RA 患者和对照组中可溶性纤维蛋白单体复合物（soluble fibrin monomer complex,SFMC）样本。样品在BD LSRII 流式细胞仪上运行，并使用FlowJo软件版本9.3.3 分析数据。抗原特异性细胞的频率计算为结合部分中CD3+T 淋巴细胞与单核细胞比值(tlymphocyte-monocyte ratio，TMR)的总数除以CD4+T 细胞的总数。
1.3.4 滑膜组织CCP/AST 染色强度：双重免疫荧光染色/激光共聚焦扫描观察滑膜组织中CCP/AST染色强度，阳性细胞为细胞膜呈清晰红、黄荧光染色，按阴性、弱、中、强分别评为 0～3 分。
1.4 统计学分析 采用软件SPSS 25.0 进行所有数据的统计分析，经Shapiro-Wilk 检验是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间数据采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验；
计数资料采用例数和百分比表示，组间比较采用χ2分析；
应用Pearson 相关性分析关节滑液、滑膜组织中CCP/AST 表达与RF 和ACPA 的相关性；
采用Logistic回归分析类风湿性关节炎发生的危险因素，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 四组滑膜组织RF 和ACPA 蛋白表达 对照组、轻度组、中度组和重度组患者滑膜组织中RF（1.01±0.01，1.53±0.03，2.01±0.08 和2.66±0.12 kDa）和ACPA（1.03±0.01，1.61±0.03，2.04±0.10和2.59±0.13 kDa）蛋白依次升高，差异具有统计学意义（F=14.207，12.446，均P＜0.001）；
与对照组比较，轻度组、中度组、重度组滑膜组织RF 和ACPA 差异具有统计学意义（t=115.816，129.179；
87.715，71.064；
97.078，84.795，均P＜0.001）。与轻度组比较，中度组、重度组RF 和ACPA 差异有统计学意义（t=38.359,28.054;61.199,49.316,均P＜0.001）。中度组与重度组比较，RF 和ACPA 差异有统计学意义（t=29.399,21.456,均P＜0.001）。
2.2 关节滑液和滑膜组织中CCP/AST 表达分析 对照组、轻度组、中度组和重度组患者关节滑液中CCP/AST表达（8.26%±1.68%，22.46%±3.28%，33.58%±4.37%和46.15%±5.44%）、滑膜组织CCP/AST 染色强度（1.05±0.26，1.35±0.89，2.04±0.56 和2.78±0.15 分）依次升高，差异具有统计学意义（F=25.306，70.670，均P＜0.05）。与对照组比较，轻度组、中度组、重度组关节滑液和滑膜组织中CCP/AST 表达差异有统计学意义（t=27.011，3.674；
38.331，12.504；
47.129，18.741，均P＜0.05），与轻度组比较，中度组、重度组CCP/AST 表达差异有统计学意义（t=14.097，4.648；
23.702，8.701，均P＜0.05）。中度组与重度组比较，差异具有统计学意义（t=11.457，7.076，均P＜0.05）。
2.3 相关性分析 轻度组、中度组和重度组患者关节滑液、滑膜组织中CCP/AST 表达与RF 和ACPA呈明显正相关（r=0.840，0.934；
0.802，0.913，均P＜ 0.001）。
2.4 RA 发生的危险因素分析 见表1。Logistic 回归分析结果显示，高血压、糖尿病以及关节滑液、滑膜组织中CCP/AST 表达均为RA 发生的独立危险因素（均P＜0.05）。
表1 Logistic 回归分析RA 的危险因素
类风湿关节炎（RA）是一种与滑膜炎和关节破坏相关的复杂炎症性疾病，其特征是滑膜关节慢性炎症、血管翳形成、进行性骨侵蚀和关节破坏，患者通常会出现关节肿胀和压痛，严重可导致残疾[10-11]。RA 的发展是一个持续的、进行性的、全身性的病理过程，在RA 发病前或早期即可在血清中检测到RF，ACPA 等多种自身抗体。
随着各种免疫、成纤维细胞和细胞因子的逐渐相互作用，滑膜组织逐渐产生慢性炎症，并伴有骨侵蚀和破坏，导致各种临床症状和损伤[12-13]。此外，许多器官系统可能会因全身性炎症而受损，例如心脏组织、血管系统、肾脏、肺组织和神经系统等，因此RA 的早诊断、早治疗尤为重要。
RA 的临床特征还在于患者血清中存在特异性自身抗体，这些抗体在临床常规中用作疾病诊断的生物标志物。类风湿因子（RF）是临床上用来辅助诊断类风湿关节炎的一个经典指标，其可结合免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的Fc 区，形成有助于疾病过程的免疫复合物，其水平升高与持续活跃的滑膜炎、关节损伤、关节炎和残疾密切相关[14]。但RF 对已确诊RA 的特异度仅在60%～70%之间。CCP 抗体是早期诊断RA 的特异性指标，临床敏感度67%～80%，特异度大于96%，与RF 的诊断敏感度相当，但特异度更高[15]。近年来，有研究发现，抗CCP 抗体阳性的RA 患者的骨破坏比阴性患者更严重，抗CCP 抗体的含量与RA 的病情严重程度及发展有关[16]。抗原多肽通过体内抗原递呈细胞的表达激活 T 淋巴细胞，释放免疫球蛋白、趋化因子和自由基等炎症介质，从而引发 RA 的特征性病理变化[17]。CD4+T 细胞通过分泌促炎细胞因子在 RA中发挥重要作用，可促进RA 炎症反应的持续存在。此外，T 细胞频率已被证明可受疾病持续时间和治疗的影响，这表明 T 细胞数量和功能的变化可反映整个疾病过程的变化[18]。研究发现[19]，环瓜氨酸化蛋白与淋巴细胞人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)分子结合，通过T 细胞的抗原递呈功能，进一步刺激RA 患者的T 细胞增殖，环瓜氨酸化蛋白是RA病理过程中的致病靶抗原，其可特异性刺激CCP/AST 的克隆增殖，并与患者病情严重程度有关。本研究结果显示，轻度组、中度组和重度组患者关节滑液中CCP/AST 表达较对照组升高，且随病情严重程度增加而升高，由此可见CD4+T 细胞参与了RA 的发生发展，其中CD4+T 亚群的失衡及其相关信号分子的紊乱在RA 的发生、发展中起着重要作用，基于CD4+T 细胞亚群平衡的免疫调节手段有望成为治疗RA 的新策略。
本研究还发现，关节滑液、滑膜组织中CCP/AST 表达与RF 和ACPA 蛋白水平间存在正相关。且Logistic 回归分析结果显示，关节滑液、滑膜组织中CCP/AST 频率均是RA 发生的独立危险因素。由此可见，RA 患者血液和滑膜组织中CD4+T 细胞被瓜氨酸自身抗原刺激后逐渐激活扩增，进一步表达促炎和细胞溶解介质，杀伤靶细胞，最后导致关节组织破坏，加重疾病。这进一步证实了风湿性关节炎患者外周血、关节滑液及滑膜组织中CCP/AST检测具备较好的临床诊断价值，并且可以用于预估病情的预后。
综上所述，RA 患者关节滑液及滑膜组织中CCP/AST 呈现高表达，且与疾病活动度及关节破坏有关，可用于评估此类患者临床关节活动度及骨破坏程度。本研究的局限性在于：未收集有关患者治疗和就诊时疾病持续时间、疾病活动性或样本提取时可能的关节外表现的信息，使得研究结果可能存在偏倚，后续研究中需要进一步扩大纳入指标及研究范围，以此证实研究结果的真实性。
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