冠心生脉丸质量标准提升

时间:2024-09-14 10:00:02 来源:网友投稿

刘静玉,金武燮,谷丽华,2,吴立宏,2*,王峥涛,2*

(1.上海中医药大学中药研究所,中药标准化教育部重点实验室,国家中医药管理局中药新资源与质量评价重点实验室,上海 201203;

2.上海中药标准化中心,上海 201203)

我国中成药产业发展迅速,目前临床应用的品种已达九千余个[1]。但随着中药市场化的高速发展,加之资源短缺等问题,导致部分中成药出现低限投料或少投料、使用近似品种掺加投料等影响质量的问题[2],含贵细药材者尤为突出,从而影响其临床有效性和安全性[3-4]。

冠心生脉丸收录于《中华人民共和国卫生部颁药品标准(中药成方制剂第六册) 》,由人参、麦冬、五味子(醋炙)、丹参、赤芍、郁金、三七7 味药材组成[5]。方中人参为君药,性甘温,益元气,补肺气,生津液;

三七与丹参、赤芍、郁金活血化瘀,扩张冠脉,其中郁金疏肝为气中之血药,三七祛瘀为血中气药,气行血调而痛可自止[6],临床上用于治疗心气不足、心阴虚弱引起的心血瘀阴、心悸气短、胸闷作痛、自汗乏力、脉微结代,冠心病、心绞痛、心律不齐等疾病[7-10]。但该制剂现行质量标准只有赤芍、丹参的定性鉴别,目前报道也大多为丹参、赤芍所含成分的含量测定[11-14],而人参和三七作为方中贵细药材,尚无定性定量评价方法,不利于其质量控制[15-16]。因此,本实验以人参和三七为研究对象,建立TLC 定性鉴别和HPLC 含量测定方法,以期提升冠心生脉丸质量标准,有助于该制剂临床疗效稳定。

1.1 仪器 Automatic TLC Sampler-4 薄层色谱全自动点样仪(瑞士CAMAG 公司);

Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);

BSA323S 电子天平(千分之一,德国Sartorius 公司);

AE200 电子天平[万分之一,梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司];

BT25S 电子天平(十万分之一,德国Sartorius 公司);

SF-TGL-16M 离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);

M5800 超声波清洗机(美国Branson 公司);

Accucore-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.6 μm) (美国Thermo Fisher Science 公司);
Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm) ( 美国 Agilent 公司);

Waters CORTECS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm)(美国Waters 公司);

TLC Silica gel 60 硅胶预制薄层板(批号HX066475,德国Merck 公司);

银龙GF254高效硅胶预制薄层板(批号20180310,烟台市化学工业研究所);

G 型高效硅胶板 (批号20170209,青岛海洋化工厂分厂);

DCFertigplatten DURASIL-20 硅胶预制薄层板 (德国MN 公司)。

1.2 试剂与药物 人参(批号120917-201712)、三七(批号120941-201810) 对照药材及人参皂苷Rg1(批号110703-202034)、人参皂苷Re (批号110754-202129)、人参皂苷Rb1(批号110704-202129)、人参皂苷Rd (批号111818-202104)、人参皂苷Rf (批号111719-201806)、三七皂苷R1(批号110745-201921)、拟人参皂苷F11(批号110841-202108) 对照品均购自中国食品药品检定研究院。

人参(批号210325)、麦冬(批号210622)、五味子(批号210710)、丹参(批号210603)、赤芍(批号210416)、郁金 (批号210515)、三七(批号210721) 均由上海康桥中药饮片有限公司提供,经上海中医药大学中药研究所吴立宏研究员鉴定为正品,符合2020 年版《中国药典》 一部规定[7]。冠心生脉丸共13 批(编号G1~G13),其中G1~G4 来自厂家1,G5~G8 来自厂家2,G9 ~G11来自厂家3,G12~G13 来自厂家4,组方药材人参9 g、麦冬9 g、五味子(醋炙) 3 g、丹参15 g、赤芍12 g、郁金9 g、三七粉0.6 g,制备方法为除三七粉以外其余6 味药材粉碎成细粉,与三七粉配研,过筛,混匀,每100 g 粉末加90 ~110 g 炼蜜,制成大蜜丸,即得。

乙腈为色谱纯(美国Fisher 公司);

甲醇等其他试剂均为分析纯 (国药集团化学试剂有限公司)。

2.1 TLC 定性鉴别

2.1.1 供试品溶液制备 取本品4 g,加2 g 硅藻土研细,加25 mL 乙酸乙酯超声提取30 min,弃去提取液,加25 mL 水饱和正丁醇超声提取30 min,取上清液,加氨试液洗涤3 次,每次50 mL,加25 mL正丁醇饱和水洗涤,取正丁醇层蒸干,加10 mL水超声溶解,经D101 大孔树脂 (内径1.5 cm,柱高15 cm),加150 mL 水洗脱,弃去水液,150 mL 35%乙醇洗脱,弃去洗脱液,150 mL 40%乙醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加2 mL甲醇溶解,过0.45 μm 微孔滤膜,即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf 及三七皂苷R1、拟人参皂苷F11对照品适量,甲醇溶解,制成质量浓度分别为0.507、0.504、0.499、0.501、0.503、0.500 mg/mL 的溶液,即得。

2.1.3 对照药材溶液制备 取人参、三七对照药材各1 g,按“2.1.1” 项下方法制备,即得。

2.1.4 阴性样品溶液制备 按处方和工艺,分别制成缺人参、缺三七、缺人参和三七的阴性样品,按“2.1.1 ” 项下方法制备,即得。

2.1.5 结果分析 按照2020 年版《中国药典》四部通则0502,分别吸取供试品、阴性样品溶液各8 μL,人参对照药材溶液4 μL,三七对照药材溶液1 μL,对照品溶液1 μL,点于同一硅胶薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶7 ∶2) 10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃下加热至斑点显色清晰,在可见光下检视,结果见图1~2。表明正品供试品色谱在对照药材、对照品色谱相应位置上显示相同颜色斑点,未检出拟人参皂苷F11,阴性样品色谱相应位置无干扰。

图1 专属性试验TLC 色谱图Fig.1 TLC chromatogram of specific tests

图2 13 批样品TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatogram of thirteen batches of samples

2.2 HPLC 含量测定

2.2.1 供试品溶液制备 取本品约4 g,精密称定,加2 g 硅藻土研细,置于具塞锥形瓶中,精密加入25 mL 水饱和正丁醇,称定质量,超声(功率300 W,频率40 kHz) 处理30 min,放冷,水饱和正丁醇补足减失的质量,摇匀,取上清液20 mL,用20 mL 氨试液洗涤,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 对照品适量,置于10 mL 量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,制成质量浓度分别为1.014、1.008、1.006、0.998 mg/mL 的贮备液,置于4 ℃冰箱中保存,取适量,甲醇逐级稀释,分别得到含人参皂苷 Rg150.7、101.4、202.8、405.6、608.4、811.2、1 014.0 μg/mL,人参皂苷Re 50.4、100.8、201.6、403.2、604.8、806.4、1 008.0 μg/mL,人参皂苷 Rb150.3、100.6、201.2、402.4、603.6、804.8、1 006.0 μg/mL,人参皂苷Rd 49.9、99.8、199.6、399.2、598.8、798.4、998.0 μg/mL 的溶液,即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 按处方和工艺,制成缺人参和三七的阴性样品,按“2.2.1” 项下方法制备,即得。

2.2.4 色谱条件和专属性试验 Thermo Accucore-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.6 μm);

流动相乙腈(A) -水(B),梯度洗脱(0 ~12 min,20%A;

12~15 min,20% ~26%A;

15 ~30 min,26% ~29%A;

30 ~38 min,29% A;

38 ~48 min,29% ~38% A;

48 ~55 min,38% A);

体积流量 0.8 mL/min;

柱温20 ℃;

检测波长203 nm;

进样量5 μL,色谱图见图3。由此可知,供试品、对照品色谱峰保留时间一致,阴性无干扰,表明该方法专属性良好;

理论塔板数按人参皂苷Re 计,应不低于5 000。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2.2” 项下对照品溶液适量,在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y) 对其质量浓度(X)进行回归,并以信噪比S/N =3 为检测限,S/N =10 为定量限,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各人参皂苷线性关系Tab.1 Linear relationships of various ginsenosides

2.2.6 精密度试验 取对照品溶液适量,同一天内在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定6 次,计算日内精密度;

同法连续测定3 d,每天3 次,计算日间精密度,测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 前者RSD 分别为0.90%、1.26%、0.98%、0.3%,后者 RSD 分别为 1.11%、1.69%、0.36%、1.04%,表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液(G4),于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.4”项色谱条件下进样测定,测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 峰面积RSD 分别为0.25%、0.54%、0.56%、1.70%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 精密称取同一批本品(G4)6 份,按“ 2.2.1” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定,测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量 RSD 分别为0.35%、1.26%、1.02%、1.53%,表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取各人参皂苷含量已知的本品(G4) 6 份,每份约2 g,精密加入100%水平的对照品溶液,按“ 2.2.1” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd平均加样回收率分别为 102.47%、98.10%、91.21%、106.86%,RSD 分别为1.29%、1.14%、1.43%、0.68%。

2.2.10 样品含量测定 取5 个厂家13 批样品适量,每批平行3 份,按“ 2.2.1” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定,计算含量,结果见表2。

表2 各人参皂苷含量测定结果(mg/g,n=3)Tab.2 Results for content determination of various ginsenosides (mg/g,n=3)

3.1 TLC 定性鉴别 皂苷类成分是人参和三七主要有效物质,其中人参皂苷Rg1、Re、Rb1为两者共有成分,人参皂苷Rf 是前者特有成分[17],三七皂苷R1是后者特有成分[18],故本实验选择其作为鉴别指标。再分别对3 种展开剂、2 种显色剂、4种薄层板进行考察,确定最佳色谱参数。然后,分别对供试品点样量(6 ~10 μL)、展开温度(4、25 ℃)、相对湿度(35%、58%) 进行考察,发现8 μL 时展开效果最佳,低温下展开分离度更好,上述相对湿度范围内展开情况稳定。

结果,样品G1~G4 色谱在对照药材、对照品色谱相应位置上显示相同颜色斑点;

G5 ~G13 中检出西洋参特有成分拟人参皂苷F11[17],但未检出人参皂苷Rf 和三七皂苷R1,推测可能含有西洋参,而不含人参和三七。

3.2 HPLC 含量测定 本实验以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 为指标,分别对提取溶剂水饱和正丁醇用量(12.5、25、50 mL)、提取时间 (15、30、60 min)、氨试液用量(20、40、60 mL)、氨试液洗涤次数(1、2、3 次) 进行考察,以各成分检出量和操作简便性为原则,确定最优方案。再分别对体积流量 (0.6、0.8、1.0 mL/min)、柱温(20、25、30 ℃)、色谱柱[Thermo Accucore C18(4.6 mm×150 mm,2.6 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm × 150 mm,2.7 μm)、Waters CORTECS C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm) ] 进行考察,根据分离度和分析时间确定最佳参数。

结果,13 批样品均含有人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd,但不同批次之间的差异较大;

上述4 种人参皂苷含量总和,以及人参皂苷Rg1、Rb1含量比值(Rg1/Rb1) 在样品G1~G4、G5~G13 之间存在明显差异。研究表明,人参、三七和西洋参中Rg1/ Rb1分别约为1.13、1.14 和0.16[19],并且两者比值低于0.4 时为西洋参的标志[20-21];

本实验中样品G1 ~G4 的Rg1/Rb1平均值为1.048±0.085,与文献报道的人参和三七接近;

G5 ~G13 其平均值为0.151±0.026,更接近西洋参。因此,为了有效控制冠心生脉丸质量,应对人参皂苷Rf、三七皂苷R1进行定性鉴别,人参和三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 进行含量测定。

根据上述实验结果,结合投料量、工艺、检测方法等因素,人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量总和限度按平均值的30% 计算,建议不得低于1.0 mg/g;

Rg1/Rb1稳定,其限度按3 倍标准偏差计算,建议不得低于0.79。

本实验针对冠心生脉丸中人参和三七,建立皂苷类成分TLC 定性鉴别、HPLC 含量测定方法,前者能有效分辨是否存在西洋参代替人参或三七投料,专属性和实用性良好;

后者以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量总和,以及人参皂苷Rg1、Rb1含量比值为指标确定限量值,可为该制剂质量标准提升提供参考。

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