铁玲 罗永海 汪常伟 江华 亚生江 龚建齐 李彦华
耳聋是人类的常见疾病,其导致语言交流障碍,严重影响人们的健康和生活质量。引起耳聋的病因很多,其中遗传因素是不可忽视的病因[1]。COCH 基因是第一个在前庭功能障碍患者中发现的常染色体显性遗传性非综合征性耳聋基因[2]。由于COCH耳聋基因在国内外报导中突变均集中在第4、5、12 外显子，故本次研究选取了这3 个外显子进行突变研究，而且COCH 基因在民族间具有高度保守性，各地区、民族的发病率和突变类型都有不同。然而，由于新疆不同民族的长期融合和交流，形成了人口整体遗传背景的复杂性以及相对的封闭性, 且不同地区不同民族群体的遗传可能存在一些差异[3，4]。因此，对于开展新疆不同地区哈萨克族及维吾尔族患者COCH 基因突变的研究具有很重要的现实意义。
1 临床资料
按纳入、排除标准确定研究对象，分别在新疆维吾尔自治区残联聋儿康复中心、乌鲁木齐市残联、喀什地区聋儿语训部以及和田、阿克苏、阿勒泰等地区的聋哑学校、语训中心，共招募195 例耳聋患者纳入实验组，均需进行耳科、听力学和全身健康体检；
将听力正常且无耳聋家族史的健康人207例纳入正常对照组。实验组基本情况为：阿勒泰地区99 例，哈密市96 例；
男98 例，女97 例；
年龄范围在14～40 岁，平均（25.9±7.15）岁。正常对照组基本情况为：阿勒泰地区104 例，哈密市103 例；
男100 例，女107 例；
年龄15～42 岁，平均（26.4±8.89）岁。肾虚血瘀型辨证分型的标准参照《中医诊断学》（第七版）及《中西医结合耳鼻咽喉科学》（第七版）制定[5，6]。
2 实验方法
所有受检者均收集外周血提取DNA，采用聚合酶链反应（PCR）产物直接测序方法进行COCH 第4、5、12 外显子基因突变检测。分析方法如下：
2.1 样本DNA 抽提
按实验室规章制度，穿工作服并且戴好手套、口罩和帽子，做好无菌环境要求以及自我防护。用血液基因组DNA 提取系统（0.1～20ml）（溶液型）目录号：DP319 进行DNA 抽提。标本血样及DNA 样品严禁反复冻融，否则影响实验效果。短期使用存放-20℃，长期储存放-80℃备用。采到新鲜血样后立即提取基因组效果最佳，DNA 反复冻融及长期不当储存,DNA 样品降解后将影响PCR 扩增效率。
2.2 PCR 扩增条件
COCH-4:95℃预变性4min，94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，进行35 个循环，反应终止后再72℃延伸5min，在4℃保存。
COCH-5:95℃预变性4min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，进行35 个循环，反应终止后再72℃延伸5min，在4℃保存。
COCH-12F:95℃预变性4min，94℃变性45s，68℃退火45s，72℃延伸1min，进行35 个循环，反应终止后再72℃延伸8min，在4℃保存。
2.3 PCR 扩增引物
COCH-4F:5’CTGGAATGGTATGGAAGGGTA 3’
COCH-4R:5’GAAAGGAAATAATCACGTCTGC 3’365
COCH-5F:5’TCTTTAGATGACTTCCCTGATG AG 3’
COCH-5R:5’CAGTTCCTTGGTAAGTATCCG 3’535
COCH-12F:5 TTCGCTGCAACTATGTAACAGT 3’
COCH-12R:5 GGTCTTTCCACATGAATTTT TAC 3’1171 正反测
3 辨证分型
由两名训练有素的中医生或中西医结合医生完成筛查工作。在初步筛查的研究对象中，经两名临床经验丰富的医生对疑似符合肾虚和血瘀诊断标准的患者进行了复诊，以确诊其病例分型，计算获得研究对象在不同地区肾虚血瘀型耳聋在所有致耳聋中的构成比。
4 统计学方法
统计软件SPSS 19.0 软件包，基因的突变频率采用计数法进行描述两组间基因型和等位基因频率的比较用χ2检验，两组分布差异的比较采用χ2检验，秩和检验，基因突变与不同证型、不同地区间的相关性采用双变量Spearman 秩相关，检验水准α=0.05。
1 中医证型分布
经中医辨证分型，195 例耳聋患者中肾虚血瘀型患者114 例，占58.5%（114/195），非肾虚血瘀型81 例，占42.6%（81/195）。肾虚血瘀组中，阿勒泰地区51 例，哈密市63 例；
非肾虚血瘀组中，阿勒泰地区48 例，哈密市33 例。经χ2检验，不同地区证型的耳聋患者分布存在统计学差异（P＜0.05）。
2 COCH 基因突变分析
本研究中COCH 第4、5 外显子均未检测到突变，COCH 第12 外显子发现3 种未报导的碱基改变形式：1760A＞T、1791A＞G、2461T＞C，均位于非编码区，不编码蛋白故为无意义突变形式（图1，2 为COCH 第12 外显子基因测序图）。耳聋实验组中发现COCH 第12 外显子突变31 例（15.9%）；
其中，1760A＞T 杂合26 例、纯合4 例，1791A＞G 杂合1例；
阿勒泰地区20 例，突变率为10.3%；
哈密市11例，突变率为5.6%。对照组中发现COCH 第12 外显子突变39 例（18.8%），其中1760A＞T 杂合36 例、纯合2 例，2461T＞C 杂合1 例；
阿勒泰地区17 例，突变率为8.2%；
哈密市22 例，突变率为10.6%。
图1 COCH 的第12 外显子1760 位A＞T，A＞A 型为野生型,A＞T 型为杂合突变，T/T 型为纯合突变
图2 COCH 的第12 外显子1791 位G＞A，A/A 型为野生型，A＞G 型为杂合突变
3 COCH 基因突变不同地区病例组和对照组间分布
经χ2检验Fisher 精确概率法发现，COCH 基因突变各位点在不同地区病例组与对照组之间的分布无统计学意义（P均＞0.05），见表1。
表1 COCH 基因突变不同地区病例组和对照组中分布比较
4 COCH 基因突变在病例组和对照组的人群分布
COCH 基因1760A＞T、1791A＞G 位点在病例组和对照组不同人群中的分布无差异（P均＞0.05）。仅有2461T＞C 基因突变位点在对照组中存在人群分布差异（P＜0.05），见表2。
表2 COCH 基因突变在病例组和对照组的人群分布比较
5 COCH 基因突变不同人群证型分布
经Fisher 精确概率法检验，COCH 基因突变在肾虚血瘀型和非肾虚血瘀型患者中的地区分布无差异（χ2=0.694，P＞0.05）。进一步分析发现，哈萨克族和维吾尔族耳聋患者中的COCH 基因突变的证型分布均无统计学意义（P＞0.05），见表3。
表3 COCH 基因突变不同人群证型分布比较
6 COCH 基因突变与民族、证型的相关性
采用双变量spearman 秩相关，分析COCH 基因突变与不同证型、不同人群的相关性。结果显示：COCH 基因突变与民族分类、证型分型均呈直线相关（RS＞0.5，P＜0.05）。
COCH 基因是在患有前庭功能障碍的人中发现的第一个常染色体显性遗传性非综合征性耳聋基因[2]。目前，国内外研究报道与耳聋相关的COCH 基因突变位点大多在第4、5、12 这三个外显子上。本研究从分析COCH 基因突变位点第12 号外显子入手，发现3 种未见报道的碱基改变形式，分别为1760AT、1791AG、2461TC；
此外COCH 基因第4、5外显子突变位点尚未被发现。国外现有研究已发现9 种COCH 基因突变导致DFNA9 型迟发性耳聋，有7 个杂合点突变和1 个氨基酸残基缺失是位于COCH第4 或者第5 外显子，编码与古代无脊椎动物鲎凝固因子C 同源的结构域；
只有一个欧洲家系的COCH基因杂合点突变位于第12 外显子，编码与vWFA同源的vWFA2 结构域。国内学者发现的COCH 基因突变位点C 542Y 和M 512T 均位于第12 外显子上[7-15]。孙勍[15]开展病例对照研究进行COCH 全序列突变分析结果显示，在DFNA 家系中发现COCH 12号外显子1625GA 杂合突变，该突变使原来542 位的半胱氨酸变成酪氨酸（C542Y）；
在遗传方式不明的迟发性耳聋小家系中发现COCH-12 号外显子1535TC 杂合突变，使512 位蛋氨酸突变为苏氨酸（M512T）。国内研究表明：COCH 全序列12 个外显子，只在12 号外显子发生突变。
本研究尚未发现国外报道较多的COCH 基因第4、5 号外显子突变位点，可能在新疆维吾尔族和哈萨克族人群中COCH 第4、5 外显子存在较低突变率。此外，本研究尚未发现COCH 基因致病突变位点；
而是发现了第12 外显子致突变位点三种形式也均为无意义突变位点。结果提示：哈密市维吾尔族较易在2461TC 基因突变位点发生突变。另外，本研究结合中医辨证分型发现195 例耳聋患者地区间症型分布存在差异，这一结果说明肾虚血瘀型患者在哈密市维吾尔族人群中检出率较高，明显高于阿勒泰地区哈萨克族耳聋患者。这一结果提示：哈密市维吾尔族耳聋患者可能与肾虚血瘀型耳聋病因关联更为密切，而哈密市维吾尔族正常人群中2461T＞C 基因突变发生比例较高。且COCH 基因突变与肾虚血瘀型具有相关性，肾虚血瘀型耳聋患者的比例较高。
综上所述，由于COCH 基因在不同地区和人群中发病率和突变类型存在明显差异。今后仍需通过扩大调查点及样本量等方法开展深入研究，以用于确定是否将第4、5 外显子作为新疆维哈人群的耳聋基因突变研究，进而发现有意义的致病基因突变位点；
这对于耳聋患者COCH 基因突变相关研究具有十分重要的科研价值。新疆不同地区耳聋患者中肾虚血瘀型占比较高，可能是COCH 基因突变差异的原因之一。新发现突变位点丰富了新疆COCH 基因突变和多态性图谱，为进一步研究新疆耳聋遗传筛查和基因库的建立奠定基础。