阮 鸣,王珍珍,贲爱玲,唐怡欣
(南京晓庄学院 食品科学学院,江苏 南京 211171)
黄芪鳝鱼汤是由黄芪、鳝鱼和山药配伍而成的验方,具有补血益气、提高机体免疫力的功效,被广泛应用于临床辅助治疗肿瘤化疗后白细胞减少症[1-4]。化疗最常见的毒副反应是粒细胞为主的白细胞数量呈进行性下降,导致人体防御能力降低,诱导各种并发症产生,威胁患者的生命[5,6]。虽然使用粒细胞集落刺激因子等升白药物能提升白细胞的数量,但维持时间短,长期使用还存在诸多不良反应[7,8]。黄芪鳝鱼汤中的黄芪和山药均为药食同源之品,《本草纲目》也记载了黄鳝的独特效用,因此该汤“寓医于食”,既将药物作为食材,又将食物赋以药用,不仅降低了病人服药的痛苦,还大大提升了白细胞减少症的治疗效果。
黄芪主要含有多糖、皂苷和黄酮类活性成分,可改善免疫系统,并具有一定的抗癌作用和显著的抗癌辅助治疗作用[9,10]。山药富含甾体皂苷类、多糖、黄酮类、酚苷类等有效成分,具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种药理作用[11]。黄鳝俗称鳝鱼,其肌肉中粗蛋白含量较高,氨基酸种类齐全,必需氨基酸、鲜味氨基酸含量丰富,属于高蛋白的优质鱼类[12,13]。黄芪鳝鱼汤的治疗作用来源于其有效成分,而有效成分的溶出与加工工艺密切相关。因此,本实验拟以黄芪鳝鱼汤中多糖、皂苷、黄酮为代表的功能成分和以蛋白质为代表的营养成分的含量为指标,结合感官评定,筛选活性组分含量高、口感佳的药膳汤加工工艺。
1.1 材料与试剂
D-无水葡萄糖,上海易恩化学技术有限公司(分析对照品,货号R017243);黄芪甲苷,上海源叶生物科技有限公司(分析标准品,HPLC≥98%,货号B20564);芦丁,北京万佳首化生物科技有限公司(对照品,HPLC≥98%,货号BW1681);黄芪,南京市益丰大药房湖西街店;鳝鱼、山药(鲜品),南京市苏果超市仙林高科荣境社区店;其余试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
RE-52A型旋转浓缩蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;L6S 紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;K9860全自动凯氏定氮仪,SH220N石墨消解仪 山东海能科学仪器有限公司;LD5-10B低速大容量离心机 北京雷勃尔医疗器械有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 鳝鱼的前处理方法
热烫法:用200 mL的沸水淋在50 g鳝鱼上,1 min后捞出。
浸泡法:取500 mL常温水浸泡50 g鳝鱼,30 min后捞出。
盐搓法:取50 g食盐均匀撒在50 g鳝鱼上,小心揉搓,直到滑腻黏膜完全去除。
鳝鱼通过前处理可达到去血、去粘膜、去腥的目的,然后再洗净,切段,备用。
1.3.2 黄芪鳝鱼汤样品的制备
按照黄芪鳝鱼汤的配方[1-4]:“黄芪30 g,新鲜山药(去皮)100 g,鳝鱼50 g”备好食材,并按照下述方法制汤。
水煮法:黄芪、鳝鱼和山药不经油炒,直接加水1000 mL、生姜少许,大火煮沸后改小火炖1 h,起锅前加葱花及食盐少许。
油炒法:黄芪、鳝鱼和山药经油炒(5 g烹调食用油,翻炒4 min), 再加水1000 mL,随后同水煮法熬汤。
将热烫水煮、盐搓水煮、浸泡水煮、热烫油炒、盐搓油炒和浸泡油炒六种工艺制得的汤汁用纱布过滤,滤液减压浓缩至85 mL,即得各黄芪鳝鱼汤样品。每份样品平行制备三次,分别标号为第①组、第②组、第③组。
1.3.3 感官鉴评
本次实验的评价小组由随机选取的10人组成,根据本产品特性,结合刘畅等人的研究,采用单盲法对黄芪鳝鱼汤的菜品口感、汤汁色泽外观、汤品滋味三个方面按表1进行评分[14],综合评分100分。具体分项为:菜品口感20分,色泽外观20分,汤品滋味60分。
表1 感官鉴评评分表
1.3.4 硫酸蒽酮法测定多糖含量
1.3.4.1 标准曲线的绘制
精密称取0.0105 g D-无水葡萄糖,加蒸馏水溶解,并定容至100 mL,得0.105 mg/mL葡萄糖标准溶液。另准确称取0.100 g蒽酮,加200 mL浓硫酸充分溶解,制得0.05%硫酸蒽酮溶液,现配现用。取具塞试管8支,编号,按照表2的要求,依次向对应的试管中加入相应的试剂[15,16]。
表2 葡萄糖标准曲线的绘制
各试管内溶液混合均匀后,置沸水浴中加热20 min,取出,迅速冷却后再置冰水浴中15 min,试管内溶液倒入比色皿,以相应试剂为空白,放入可见分光光度计检测,检测波长为625 nm。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量为横坐标,绘制葡萄糖标准曲线。
1.3.4.2 黄芪鳝鱼汤中多糖的含量测定
参照文献[15,16]方法测定黄芪鳝鱼汤中多糖含量,具体步骤为:精密量取1.3.2节下样品5 mL,加入95%的乙醇溶液至醇浓度为80%,冷藏过夜,离心过滤10 min,转速为4000 r/min,弃去上清液,沉淀加蒸馏水溶解,并定容至10 mL。吸取该溶液0.25～0.60 mL,置于10 mL具塞试管中,加蒸馏水至2 mL,再加入硫酸蒽酮溶液6 mL,混合均匀,置沸水浴中加热20 min,再在冰水浴中放置15 min,测得相应吸收度值,并根据葡萄糖标准曲线,计算黄芪鳝鱼汤样品中多糖的含量。
1.3.5 凯氏定氮法测定蛋白质含量
称取1.3.2项下鱼汤样品15 g,精确至0.0001 g,移入消化管,参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的分光光度法测定黄芪鳝鱼汤中蛋白质的含量。全自动凯氏定氮仪参数设置:标准酸溶液1000 mL,蛋白系数5.71,硼酸30 mL,稀释水20 mL,碱液40 mL,蒸馏5 min。
1.3.6 香荚兰醛-高氯酸法测定皂苷含量
1.3.6.1 标准曲线的绘制
精密称定黄芪甲苷对照品0.0067 g,用甲醇溶解,并定容至10 mL。取10 mL的具塞试管8支,编号0～7号,依次准确吸取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL的黄芪甲苷对照品溶液加入试管中,在105 ℃烘箱中使其充分干燥后,冷却至室温,依次向各试管中加入5%香荚兰醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸1.2 mL,混合均匀,80 ℃水浴加热25 min,取出,快速冷却,再加入冰醋酸5 mL,迅速摇匀,以相应试剂为空白,放入可见分光光度计中,将检测波长设为540 nm,读数即为对应的吸收度值。以吸光度为纵坐标,以黄芪甲苷质量为横坐标,绘制黄芪甲苷标准曲线。
1.3.6.2 黄芪鳝鱼汤中皂苷的含量测定
参照文献[17,18]方法测定黄鳝鱼汤中皂苷含量,具体步骤为:精密量取1.3.2节下样品溶液5～15 mL,抽滤,滤液加水饱和正丁醇10 mL萃取,正丁醇层备用,水层再重复萃取5次。将6次正丁醇层溶液合并,加1% NaOH水溶液30 mL洗涤,弃去水层,正丁醇层同法再洗涤1次,然后加正丁醇饱和的水30 mL萃取,最后将正丁醇层溶液置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解,并定容至25 mL。精密量取该残渣溶液4 mL,并定容至10 mL,离心10 min,转速为4000 r/min,准确量取离心液0.5 mL,按标准曲线绘制方法测定,并根据标准曲线,计算汤中总皂苷的含量。
1.3.7 NaNO2-Al(NO3)3比色法测定黄酮含量
1.3.7.1 标准曲线的绘制
精确称取芦丁对照品10.5 mg,加无水乙醇溶解,并定容至25 mL,得0.42 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取芦丁对照品溶液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mL,分别置于25 mL容量瓶中,再在每个容量瓶内加入5% NaNO2溶液1 mL,摇匀后静置6 min,继续加入10% Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀后静置6 min,最后加入4% NaOH溶液10 mL,并用无水乙醇定容至刻度,摇匀后静置15 min,以试剂空白为对照,在510 nm处测定吸光度值,以芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标(X),吸光度值为纵坐标(Y),绘制标准曲线。
1.3.7.2 黄芪鳝鱼汤中黄酮的含量测定
参照文献[19,20]方法测定黄芪鳝鱼汤中黄酮含量,具体步骤为:精密量取1.3.2节下样品溶液5 mL,抽滤,滤液放入蒸发皿中置水浴蒸干,加10 mL无水乙醇溶解,溶液离心10 min,转速为4000 r/min,取上清液于100 mL容量瓶中,加无水乙醇定容,精密量取该溶液1～2 mL置于另一25 mL容量瓶中,按照标准曲线项下方法进行显色反应和吸光度测定。
2.1 感官鉴评
根据表3可知,盐搓油炒法制备的黄芪鳝鱼汤综合评价分值最高,主要因为其汤品滋味和色泽外观分值占比高,达73.6分。虽然浸泡水煮的菜品口感分数最高,且高出盐搓油炒47.2%,但是其综合评价分值最低,仅为52.3分,因此浸泡水煮法和热烫水煮法不适合黄芪鳝鱼汤的制备(综合评价不及格)。此外还可以看出,油炒后再水煮(表3中3种油炒法,下同)的汤在色泽外观、汤品滋味和综合评价中的分数均较高,说明油炒是影响黄芪鳝鱼汤感官的关键加工工艺;直接水煮制备的汤总评分值普遍较低,但就热烫、盐搓和浸泡三种处理鳝鱼的方式来看,盐搓法更胜一筹。这两点也说明了盐搓油炒法总评分值最高的原因。总体看来,药膳汤的感官评价分值无法和普通鱼汤相比,最高也未能达到90分以上,这与药膳汤不加过多调料有关。
表3 不同加工方法对黄芪鳝鱼汤感官的影响
2.2 硫酸蒽酮法测定多糖含量
标准曲线线性回归方程为y=2.8741x+0.0151,R2=0.9991>0.999,说明葡萄糖质量在0.021～0.147 mg之间线性关系良好。
由表4可看出,直接水煮制备的黄芪鳝鱼汤中多糖含量均远高于油炒后水煮的汤,说明水煮法是获得多糖的关键工艺条件,这可能与多糖的水溶性相关。其次在三种油炒法中,盐搓油炒的汤中多糖含量最高,分别比热烫油炒法和浸泡油炒法高出46.3%和56.9%,表明盐搓法可以促进多糖的溶出,是增加多糖含量的次关键加工工艺。因此,盐搓水煮的汤中多糖含量最高。
此外,浸泡水煮、热烫油炒、盐搓油炒和浸泡油炒四种制备工艺所得汤中的多糖含量均显著低于盐搓水煮组(P<0.01),热烫水煮法和盐搓水煮法之间虽未见显著差异(P>0.05),但后者在均数上依然优于前者。
由于热烫油炒法和浸泡油炒法的多糖含量过低,故不建议使用这两种方法制备黄芪鳝鱼汤。
表4 85 mL黄芪鳝鱼汤中多糖质量的测定结果 单位:mg
2.3 凯氏定氮法测定蛋白质含量
表5的数据显示,6种加工方法对蛋白质的影响与多糖极为相似,即水煮法是获得蛋白质的关键加工工艺,这可能与蛋白质的水溶性有关;盐搓法不管是与水煮法搭配还是与油炒法并用,都可以明显促进蛋白质的溶出,是增加蛋白质含量的次关键加工工艺。因此,盐搓水煮的汤中蛋白质含量最高。其中热烫油炒法制得的汤中蛋白质含量仅为盐搓水煮的1/5,故不适宜黄芪鳝鱼汤的制备。此外,与盐搓水煮法相比,其他5种加工工艺制备的汤中蛋白质含量均显著低于盐搓水煮组(P<0.01)。
表5 85 mL黄芪鳝鱼汤中蛋白质质量的测定结果 单位:mg
2.4 香荚兰醛高氯酸法测定皂苷含量
标准曲线线性回归方程为y=4.122x-0.0246,R2=0.9990≥0.999,说明在黄芪甲苷含量为0.0670～0.2375 mg之间线性关系良好。
从表6的数据可以看出,油炒法制备的汤中皂苷含量均高于水煮法,这与皂苷的溶解性一致;盐搓法比热烫法和浸泡法更有利于提高皂苷的含量。与盐搓油炒法相比,其他5种加工工艺制备的汤中皂苷含量均显著低于盐搓油炒组(P<0.01,P<0.05)。盐搓油炒组的皂苷含量高于盐搓水煮组84.9%。因此,盐搓油炒是黄芪鳝鱼汤中皂苷溶出的关键加工工艺。
表6 85 mL黄芪鳝鱼汤中皂苷质量的测定结果 单位:mg
2.5 NaNO2-Al(NO3)3比色法测定黄酮含量
标准曲线线性回归方程为y=19.749x+0.0016,R2=0.9993≥0.999,说明在芦丁含量在0.0101～0.0437 mg/mL之间线性关系良好。
由表7可知,6种制备方法对汤中黄酮的影响与皂苷相似:盐搓油炒是黄芪鳝鱼汤中黄酮溶出的关键加工工艺,其制备的汤中黄酮含量最高,且高于盐搓水煮法78.3%。与盐搓油炒法相比,其他5种加工工艺制备的汤中黄酮含量均显著低于盐搓油炒组(P<0.01)。结合表6和7可看出,浸泡水煮法加工的汤中皂苷和黄酮含量均最低,故不宜用于黄芪鳝鱼汤的制备。
表7 85 mL黄芪鳝鱼汤中黄酮质量的测定结果 单位:mg
黄芪鳝鱼汤是药食两用汤剂,且其疗效已在人体上得到验证[1-4],因此从功能性和营养性角度考察其加工工艺很有意义。《中国药典》规定,黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,性微温、味甘,为我国传统补气中药材,主要含有多糖、皂苷和黄酮类活性物质。已有研究表明黄芪多糖可通过提高免疫器官指数、促进免疫细胞增殖、刺激细胞因子释放、影响免疫球蛋白分泌和免疫信号传导来调节免疫功能;也能通过增强免疫、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移等作用,显示出其特有的抗肿瘤特性[21]。此外黄芪皂苷被认为是结肠癌治疗中一种有效的辅助药物,能与其他西药化疗药物联合使用以减少后者的副作用[22]。黄芪中的两个三萜糖苷型皂苷在不刺激小鼠炎症细胞因子的情况下可产生强大的免疫调节作用[23]。此外黄酮亦是黄芪的主要免疫调节成分之一[24]。山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎,性平、味甘。山药多糖具有免疫调节、自由基清除活性[25]。山药皂苷元可抑制肝癌细胞中一种致癌因子(TAZ)的表达,从而间接抑制肝癌细胞的增长、诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞迁移和侵袭[26]。山药黄酮是有效的抗氧化活性物质,可有效的清除体内自由基,预防肿瘤,并对山药的感官和风味产生影响[27]。鳝鱼营养物质丰富,其中蛋白质高达180 mg/g[28]。鳝鱼中的优质蛋白有助于增强人体抵抗力,故选为黄芪鳝鱼汤的营养性成分指标。黄芪鳝鱼汤可以辅助治疗肿瘤化疗后白细胞减少症,这与其促进人体免疫功能密切有关[1],而后者已被证明是治疗免疫相关疾病(例如癌症)的重要手段[24]。因此黄芪和山药中的多糖、皂苷和黄酮是黄芪鳝鱼汤的功能性成分。
综上所述,盐搓水煮法和盐搓油炒法更加适宜黄芪鳝鱼汤的制备,因此盐搓黄鳝是该汤加工的关键工艺,有利于功能成分和营养成分的溶出。油炒是影响黄芪鳝鱼汤风味的关键工艺条件,同时也是提高汤中皂苷和黄酮含量的有效方法;不油炒直接水煮能增加多糖和蛋白质的溶出,故也是不可缺少的加工工艺。黄芪鳝鱼汤既可以应用于临床治病,又可以作为家庭日常保健饮食。因此,本论文的研究结果不仅为科学制备黄芪鳝鱼汤提供了依据,也为日后方便黄芪鳝鱼汤的工业化生产提供了参考。
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