范梦磊 陈 可 鲍文扬 杨舒凡 陶 瑞 王小云
南通大学无锡临床学院消化内科（214002）
肠纤维化是炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）并发肠梗阻的重要原因之一。纤维化是由炎症引起的“生理过程”，在炎性受损的肠道组织修复过程中，肠成纤维细胞代偿性地激活、增殖、扩张成肠肌成纤维细胞，后者分泌适宜水平的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）进行组织损伤修复。一旦组织损伤修复完成后，ECM 被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）降解，肠肌成纤维细胞发生凋亡或恢复到非激活状态。但在IBD 中，肠成纤维细胞在慢性炎症反应的反复刺激下被持续激活为肠肌成纤维细胞，继而分泌过量的ECM，当ECM 的产生与降解失衡，就会导致肠纤维化发生[1]。核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是细胞内抗氧化应激反应的重要转录因子，具有抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）自由基和炎症反应的作用[2]。近年研究表明Nrf2 在肠纤维化中通过多种途径发挥保护作用，本文简要综述Nrf2在IBD相关肠纤维化进程中发挥的作用和相关机制。
Nrf2 由NFE2L2 基因编码，分子质量为67.8 kDa，是细胞内氧化应激反应的抑制性转录因子，与调节细胞内稳态有关。生理条件下，位于细胞质的Nrf2 与其抑制子Kelch 样ECH 关联蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）稳定结合，前者持续地被Keap1-Cul3 泛素连接酶E3 复合体泛素化，并可被蛋白酶降解[3]。在炎症反应或应激状态下，巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶通过呼吸作用产生大量具有细胞毒性的ROS[4]。这些ROS还可以氧化Keap1中的半胱氨酸残基，使Keap1-Cul3 泛素化系统遭到破坏，Nrf2 便不再被降解，并与Keap1 解离后移位到细胞核中[5]。在细胞核中，Nrf2与小Maf 蛋白形成异二聚体，并与抗氧化基因的上游启动子区的抗氧化原件结合，继而激活血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）等抗氧化基因的表达，进而促进下游抗氧化酶的表达来清除ROS氧自由基[6]。
在正常生理情况下，肠上皮细胞受病原体、炎症因子刺激后可释放趋化因子，以招募炎性巨噬细胞和中性粒细胞吞噬入侵的病原体，细胞内的NADPH 氧化酶通过呼吸作用产生适量水平的ROS，开始启动对病原体直接杀伤的氧依赖途径[7]。ROS又可以通过激活核因子-κB（nuclear factor-κB,NFκB）、NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3 炎症小体等途径刺激炎症因子的增加，促使肠上皮细胞炎症反应加剧，发挥肠上皮细胞的“自身防卫”功能[8]。此时，这些ROS 和炎症因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β 等可作为致纤维化因子激活具有分泌ECM 能力的肠肌成纤维细胞，通过产生和释放ECM 对受损的肠黏膜组织进行修复[9]。为避免过量的ROS 和炎症因子引发慢性持续性肠黏膜炎症反应，在ROS和炎症因子的刺激下Nrf2代偿性活化并调控下游抗氧化酶的表达，清除过多的ROS和炎症因子，使其在细胞中维持适宜水平。Nrf2与ROS之间维持微妙的平衡关系，即氧化还原平衡，既不会使ROS水平过低不利于清除外源性病原体，又不会使ROS水平过高引起肠黏膜炎症反应的持续加剧，继而抑制了肠肌成纤维细胞的持续过度激活，使ECM 蛋白的生成与降解之间保持平衡，显著抑制肠纤维化的发生。Khor等[10]证明，在缺乏Nrf2的小鼠中诱发急性结肠炎会导致肠黏膜炎症反应加重，Nrf2是保护肠上皮屏障完整性的重要转录因子。
1.Nrf2 与NF-κB 信号通路介导的肠纤维化：NF-κB 信号通路促进肠道炎症反应和相关肠纤维化的发生。Rahmani等[11]证明在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎相关的肠纤维化模型中，瑞格色替（rigosertib）可通过抑制NF-κB 激活来降低小鼠结肠组织胶原沉积和促纤维化基因Col1a1、Col1a2、Acta2 的表达，以此达到缓解肠纤维化的作用。MMP-9 可通过刺激成纤维细胞活化和胶原合成来促进肠纤维化，同样受到NF-κB 的调节，辅酶Q10 通过抑制NF-κB/MMP-9 通路可减轻放射性肠病相关肠纤维化程度[12]。在三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS）诱导的小鼠慢性结肠炎相关纤维化模型中，特异性阻断NF-κB可抑制肠道炎症反应和ECM的广泛沉积[13]。
Nrf2及其调节的抗氧化酶不仅具有抗氧化能力，还能直接抑制NF-κB 的激活及其调控的具有促纤维化作用的炎症因子，以此达到缓解肠纤维化的作用。作为Nrf2 激动剂，寡聚糖可通过抑制NF-κB 及其下游TNF-α、IL-6 炎症因子来减少TNBS 诱导的结肠炎相关肠纤维化模型大鼠的肠道Ⅰ型胶原蛋白和α 平滑肌肌动蛋白沉积[14]。同样，有研究[15]表明药物黄腐酚（xanthohumol）能通过激活Nrf2/RAGE/NF-κB 缓解2型糖尿病诱导的肝纤维化。
2.Nrf2与辅助性T 细胞（T helper cell,Th）17/调节性T 细胞（regulatory T cell,Treg 细胞）失衡介导的肠纤维化：Treg 细胞具有免疫调节功能，Th17 则较多地发挥启动细胞炎症反应的作用，Th17/Treg 细胞失衡不仅破坏肠道免疫稳态，还在肠道炎症反应和肠纤维化中发挥关键作用[16]。在肠道炎症反应和相关肠纤维化中，Th17 及其分泌的IL-17 炎症因子发挥促进作用，而由Treg 细胞分泌的IL-10 则发挥抑制作用。对IL-10基因敲除小鼠予以IL-10治疗，可促进肠道组织抑制素的表达并缓解IBD 相关肠纤维化水平[17]。Li 等[18]的研究表明与IgG 处理的TNBS 小鼠结肠炎相比，经IL-17 抗体处理的TNBS 小鼠结肠炎和肠纤维化明显改善，胶原蛋白3、IL-17、TNF-α、MMP 抑制剂-1 和MMP-2 mRNA 和蛋白表达水平均明显降低。Zhang 等[19]发现在TNBS 诱导的小鼠慢性结肠炎模型中，予以IL-17A 抗体治疗可通过减少上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）来减轻结直肠纤维化。药物黄蜀葵花总黄酮通过降低TNBS 小鼠结肠炎血清和组织中IL-17水平，以及升高由Treg细胞产生的IL-10水平来调节Th17/Treg 细胞平衡，继而抑制纤维化相关胶原Col1a2、Col3a2 和平滑肌肌动蛋白表达，减缓肠纤维化发生、进展[20]。
Nrf2 及其下游抗氧化酶HO-1 可以通过调节Th17/Treg细胞平衡减轻IBD 肠道炎症反应。研究表明HO-1促使小鼠结肠炎模型中肠系膜淋巴结和脾脏的Th17/Treg细胞比例下降，并下调维甲酸相关孤儿受体γt的表达和IL-17A 水平，上调Foxp3 的表达和IL-10 水平，促使初始CD4+T 细胞从Th17向Treg细胞分化，从而减轻小鼠结肠炎症反应[21]。双氢青蒿素在小鼠结肠炎模型中通过促进肠黏膜组织中HO-1表达来降低脾脏和肠黏膜固有层中Th1、Th17、Th9 和Th22 细胞数量，增加Treg 细胞数量[22]。以上多项研究为Nrf2/HO-1 通过调节Th17/Treg 细胞平衡减轻IBD 肠道炎症相关纤维化提供了证据。
3.Nrf2与转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β1/Smads 信号通路介导的肠纤维化：①TGF-β1/Smads 信号通路通过产生ROS促进肠纤维化。TGF-β1作为经典的促纤维化因子，主要由间质细胞或巨噬细胞产生，通过TGF-β1/Smads 信号通路的经典途径促进Snai1 等促纤维化基因转录[23]。近年来发现ROS是诱导肠纤维化的重要介质，ROS可作为TGF-β1/Smads 信号通路的下游分子，对肠纤维化有促进作用[9]。肠成纤维细胞表面的TGF-β1配体-受体复合物经胞内的磷脂酰肌醇3-激酶或SMAD2/3 蛋白激活NADPH 氧化酶4，继而促进ROS 产生。ROS 的增多可通过促进肠成纤维细胞激活转化为肠肌成纤维细胞、EMT、纤溶酶原激活物抑制剂1 表达增加等方式促进肠纤维化[24]。肠上皮细胞在EMT 过程中失去自身的分化表型，转变为间质细胞，以此获得分泌ECM 蛋白的潜力。Rieder等[25]发现，清除过多的ROS能抑制TGF-β1 引发的EMT 进程，继而抑制肠纤维化。纤溶酶原激活物抑制剂1 通过抑制ECM 蛋白的降解促进肠纤维化进展。此外，TGF-β1又通过抑制抗氧化酶如HO-1、谷胱甘肽过氧化物酶、SOD 等的表达，间接减少了ROS 的消除[26]。同样ROS可促进非活性状态的TGF-β1前体脱离TGF-β结合蛋白和TGF-β 前肽而被激活增多，继而促进TGF-β1/Smads信号通路介导肠纤维化作用[27]，以此形成ROS 和TGF-β1 共同增多的恶性循环，ROS 和TGF-β1/Smads 信号通路发挥协同作用，共同推动IBD 肠纤维化的发生、进展。②Nrf2 通过抑制TGF-β1/Smads 信号通路延缓肠纤维化。Nrf2 及其调节的抗氧化酶通过清除体内ROS 抑制TGF-β1/Smads 信号通路，继而抑制下游NOX4 释放更多的ROS，减弱了ROS 和TGF-β1 的促肠纤维化协同作用[24,26]。Guan 等[28]在小鼠肠纤维化模型中给予Nrf2激动剂特丁基对苯二酚处理，小鼠结肠组织中的TGF-β1 及其下游Smad2/3 通路蛋白表达降低，炎症指标如髓过氧化物酶、TNF 和纤维化指标如Ⅰ型胶原纤维、平滑肌肌动蛋白的mRNA和蛋白表达均降低。应用荧光探针检测TGF-β1 刺激肠成纤维细胞后ROS 的表达升高，而特丁基对苯二酚预处理过的肠成纤维细胞的ROS、TGF-β1水平明显降低。在小鼠慢性结肠炎相关肠纤维化模型中，实验组的Nrf2 及其下游抗氧化酶HO-1 表达较对照组下降，蛆虫提取物通过上调Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1 mRNA和蛋白表达来抑制TGF-β1/Smads 信号通路，从而抑制肠纤维化，而在Nrf2抑制剂（ML385）预处理后蛆虫提取物对肠纤维化的保护作用被消除[29]。Nrf2还可以在其他器官纤维化中起到保护作用，有研究[30]表明Nrf2 通过清除ROS 和抑制TGF-β1/Smads 信号通路逆转肾纤维化。Nrf2 还可通过抑制TGF-β1/Smads信号通路，减弱肝星状细胞的激活继而抑制肝纤维化，达到肝纤维化的治疗目标[31]。在系统性硬化病中，抗氧化剂肉桂醛激活Nrf2途径，缓解了TGF-β1和IL-13介导的ROS产生，以及随后的成纤维细胞中ECM 的上调，继而延缓全身多器官纤维化的进展[32]。TGF-β1/Smads 信号通路不仅通过产生ROS 促进肠纤维化，还可以通过经典途径促进Snai1 等促纤维化基因的表达，Nrf2能否完全阻断TGF-β1/Smads信号通路的促纤维化途径还不得而知，但一系列研究表明Nrf2至少可以在一定程度上延缓肠纤维化进展。
4.Nrf2 在IBD 肠道炎症反应和相关肠纤维化中异常表达：有研究发现Nrf2在IBD患者炎症节段肠黏膜的表达水平明显低于非炎症节段[33]。而在小鼠实验性结肠炎模型中，实验组结肠组织中Nrf2及其调节的下游SOD、还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）、过氧化氢酶等抗氧化酶表达水平较对照组下降[34]。SOD 在IBD 患者肠黏膜组织中的活性较健康人明显降低，且降低程度与IBD 的严重程度呈正比[35]。GSH 是Nrf2调节的抗氧化多肽，在ROS的刺激下会失去抗氧化能力并转化为氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized,GSSG），GSH/GSSG比值可作为机体抗氧化能力指标之一。研究发现在克罗恩病患者的正常和炎症肠段中的GSH 水平和GSH/GSSG比值均降低，GSH 在溃疡性结肠炎（UC）患者结肠组织中的表达低于健康人肠组织[36]。ROS 在小鼠实验性结肠炎模型和IBD 患者结肠黏膜组织中水平均升高[37]。在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠慢性结肠炎相关肠纤维化模型中，实验组结肠组织的Nrf2表达较健康对照小鼠显著降低[29]。
在正常情况下，肠黏膜屏障受到外界病原体或细菌入侵时，固有层内巨噬细胞的Nrf2 代偿性升高，通过清除过多的ROS和炎症因子避免肠道炎症的持续放大，被激活的肠肌成纤维细胞数量下降，分泌适宜水平ECM 蛋白进行组织损伤修复。在IBD肠道炎症和相关肠纤维化中，结肠组织Nrf2表达水平降低，导致其对NF-κB 信号通路、TGF-β1/Smads 信号通路抑制性下降，Th17/Treg 细胞比例失衡，继而产生过量的ROS、TNF-α、IL-17 和TGF-β 等致纤维化因子[1]，过度激活肠肌成纤维细胞并大量分泌ECM 蛋白，促进了肠纤维化进展（图1）。可见激活Nrf2靶点可为未来治疗IBD并发肠纤维化提供新的思路。
Nrf2 为IBD 治疗药物提供了新的视角，目前在维持IBD缓解方面常用的药物是5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid,5-ASA）。研究表明，5-ASA 的作用机制与Nrf2 活性部分相关，5-ASA 被肠道中性粒细胞产生的次氯酸氧化后获得亲电性醌成为氧化型5-ASA，并与Keap1 共价结合，导致Nrf2 从Nrf2/Keap1 复合物中释放。由于氧化应激和次氯酸的产生与炎症反应和中性粒细胞浸润结肠黏膜有关，因此仅在炎症黏膜中观察到5-ASA 活化作用，而在健康肠黏膜中未观察到。与此概念平行，5-ASA 直肠给药可诱导炎症结肠组织中的Nrf2 的核积累和HO-1 蛋白表达增多，但在正常结肠组织中未见，进一步支持了5-ASA作用是炎症依赖性的观点[38]。
Keap1 是Nrf2 的负调节因子，现有的新疗法通过靶向Keap1 分子治疗UC。Lu 等[39]进行的两阶段研究评估Keap1抑制剂CPUY192018 对UC 小鼠模型中Nrf2 下游分子影响，发现随着CPUY192018 在细胞核内的累积增多，NCM460 结肠细胞内Nrf2 表达水平增加，并发挥典型的Nrf2 相关分子效应，增加抗氧化酶的表达，并通过清除ROS 减轻UC 肠黏膜炎症反应。
吴茱萸次碱、高良姜黄素等可通过上调Nrf2表达水平降低小鼠实验性结肠炎中炎性标志物水平[40-41]。在动物实验性结肠炎并发肠纤维化模型中，寡聚糖、蛆虫、特丁基对苯二酚等通过激活Nrf2降低肠纤维化指标，发挥缓解肠纤维化进展的作用[14，28-29]。但在人肠纤维疾病中，尚鲜见以Nrf2 为靶点的相关药物治疗，其具有较大的研究潜力。
综上所述，Nrf2 是一种抗氧化应激的转录因子，促进了下游抗氧化酶的表达。Nrf2 可通过抑制NF-κB 激活、调节Th17/Treg 细胞平衡抑制肠纤维化，又能通过清除ROS 来抑制TGF-β1/Smads 信号通路，继而抑制肠纤维化。但其并不阻断TGF-β1/Smads 信号通路经典途径的Snai1 等促纤维化基因的表达，因此Nrf2对肠纤维化的抑制程度还有待于进一步研究。在IBD 中，Nrf2 及其调节的抗氧化酶水平降低，对上述通路的调节性下降，不足以清除具有致纤维化作用的ROS和炎症因子，对肠道炎症反应和相关肠纤维化保护作用均下降。Nrf2在IBD 中抗纤维化的作用机制尚未明确，具有较大的研究潜力，研发以Nrf2为靶点的药物可为IBD的治疗开辟一条新途径。
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