唐新茹 丁倩倩 金红兰 黄晓光 王雪 孙雪 杨慧
摘 要：采用气相色谱-质谱联用技术测定溴地斯的明原料药中溴甲烷的残留量，应用HP-1ms（30 m×0.25 mm×1.0 μm）毛细管柱分离样品，设置起始柱温为40 ℃、载气为氦气、柱流量为1.0 mL/min，质谱检测方式为选择性离子检测（SIM），目标离子的m/z为94。结果表明，在此色谱条件下，溴甲烷与溴乙烷及相邻杂质峰之间能较好分离，且空白溶剂、溴地斯的明不干扰检测；
溴甲烷的线性关系在10.00～100.00 ng/mL区域内表现良好（r=0.999）；
平均回收率为98.53%（相对标准偏差RSD=1.26%，n=9）；
检测限和定量限分别是1.50、3.00 ng/mL。由此可得结论，该测定方法专属性较好、灵敏度高，能用于溴地斯的明中溴甲烷的检测。
关键词：溴地斯的明；
溴甲烷；
气相色谱-质谱联用法；
基因毒性杂质
溴地斯的明（Distigmine Bromide）的分子式为C22H32Br2N4O4，相对分子质量为576.32。溴地斯的明片中溴地斯的明的质量分数不低于95.00%且不超过标示量的105.00%[1]。溴地斯的明是一种人工合成的可逆性胆碱酯酶抑制剂，属于氨基甲酸酯类，由Schmid于1950年首次合成。其化学结构由两个吡啶斯的明分子组成，由环氧亚甲基结构连接。在一些亚洲和欧洲国家，包括日本和德国，其主要临床适应症是重症肌无力[2-3]。然而，其在日本也被用于治疗青光眼和膀胱活动不足，特别是用于治疗下尿路功能障碍以及手术、脊髓损伤和糖尿病引起的神经源性膀胱活动不足，还可以有效治疗药物和前列腺增大所致的尿液排泄功能障碍[4]。
溴甲烷（Bromomethane）又名甲基溴，是一种有机化合物，味甜，无色，可用在土壤中熏蒸杀虫[5-6]。其主要损伤人体的呼吸道，中毒患者的临床表现为头痛恶心、四肢无力、头晕及走路不稳、言语不清及酒醉感，严重者会出现高热、意识模糊、癫痫甚至多种器官损伤[7]。溴甲烷的沸点是4.0 ℃，气体的穿透力很强，因为不易燃易爆，所以可用作灭火剂、冷冻剂及甲基化剂等[5]；
基因毒性杂质能直接破坏DNA并引起突变、重组，能间接引起染色体断裂最终致癌变及致突变性的物质[8-9]；
安全阈值很低，低浓度即可导致癌变。随着法律法规的逐渐完善，对基因毒性杂质的检测要求越来越严格，充分合理的基因毒性杂质研究决定了产品是否可以上市，这对企业的监管要求也更高[10]。因此，建立一种能对溴地斯的明中的溴甲烷残留量进行准确检测的方法是必要的。根据人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization，ICH）[11]M7指南确定溴甲烷的限度，因为未查询到溴甲烷的TD50数值，所以采用日安全剂量1.5 μg进行计算。溴地斯的明的最大日剂量为20 mg，遗传毒性杂质溴甲烷的限度约为75×10-6。鉴于对溴甲烷的严格控制要求，确定溴甲烷的限度为1×10-6。比较常见的原料药中基因毒性杂质检测方法有高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和气相色谱（Gaschromatography，GC）等，但溴地斯的明中的溴甲烷限度较低，常规的单一仪器检测方法灵敏度和专属性达不到要求。因此，本研究建立了气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）对溴甲烷进行测定，且该检测方法经过方法学验证能准确、可靠地检测溴甲烷的含量，为溴地斯的明中其他基因毒性雜质的检测提供参考[12-14]。
1 仪器与试剂
1.1 试验仪器
气相色谱-质谱联用仪（7010B-8890，Agilent公司）；
毛细管色谱柱（HP-1ms）；
电子天平（BT-125D型，Sartorius公司）。
1.2 试验试剂
乙醇（色谱纯，Eternal公司）；
溴甲烷（批号：218061559，AccuStandard公司）；
溴乙烷（687432，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；
溴地斯的明（批号：220706、220712、220713，吉林省博大伟业制药有限公司）。
2 方法与结果
2.1 GC-MS条件
2.1.1 色谱条件
采用规格为30 m× 0.25 mm×1.0 μm的HP-1ms毛细管柱，载气为氦气，柱流量为 1 mL/min；
进样口温度为200 ℃；
顶空平衡温度为50 ℃，平衡时间为20 min；
初始柱温为 40 ℃，维持3 min；
以25 ℃/min升至290 ℃，维持5 min。
2.1.2 质谱条件
采用电离源EI，离子源温度为230 ℃，传输线温度为290 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离电压为70 eV，碰撞器为氮气，溶剂延迟1 min，采集模式为选择性离子检测（Selected Ion Monitor，SIM），溴甲烷的采集离子为97，溴乙烷的采集离子为108。
2.2 溶液配制
2.2.1 对照品溶液的制备
精确称取适量溴乙烷加乙醇稀释，制成每1.00 mL中约含溴乙烷1 mg的溶液，再精确量取适量溴乙烷加水稀释，制成每1.00 mL中约含溴乙烷100 ng的溶液，作为内标溶液；
精确量取适量溴甲烷对照品溶液，用内标溶液稀释，配制成每1.00 mL中约含50 ng溴甲烷的溶液，精确量取2.00 mL作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精确称取适量溴地斯的明，加溴乙烷定位溶液溶解，再用溴乙烷定位溶液稀释至适当浓度，精确量取2.00 mL置于顶空瓶中作为供试品定位溶液。
2.2.3 混标溶液的制备
精确称取适量溴地斯的明，加溴乙烷定位溶液溶解并稀释至适当浓度，精确加入适量溴甲烷对照品，摇匀，精确量取2.00 mL作为混标溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性考察
分别精确量取配制好的供试品溶液2.00 mL、溴甲烷对照品溶液2.00 mL、溴乙烷对照品溶液2.00 mL、混标溶液2.00 mL置于顶空瓶中，进样结果如图1—5所示。
结果表明，在此色谱条件下，溴甲烷与溴乙烷及相邻杂质峰之间能较好地分离，且空白溶剂、溴地斯的明不干扰检测。
2.3.2 检测限和定量限试验
精确量取适量溴甲烷对照品溶液及溴乙烷并称定，用水稀释至不同浓度，按规定色谱条件进样，主成分信噪比约为10∶1及3∶1时的进样质量浓度分别为定量限及检测限。测定结果表明，溴甲烷的检测限为1.50 ng/mL、定量限为3.00 ng/mL，溴乙烷的检测限为5.04 ng/mL、定量限为10.08 ng/mL。
2.3.3 线性关系考察
精确量取适量溴甲烷对照品溶液，以内标溶液稀释成每1.00 mL中约含溴甲烷500 ng的溶液，作為线性储备液。精确量取线性储备液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用内标溶液稀释并定容。分别精确量取上述溶液各2.00 mL置于顶空瓶中，密封，50 ℃预热20 min，顶空进样，记录结果。以质量浓度为横坐标，以溴甲烷与溴乙烷峰面积的比值为纵坐标，结果线性回归方程为：Y=0.023X－0.098，相关系数r=0.999。所得结果表明当进样量为2.00 mL时，在10.00～100.00 ng/mL范围内，质量浓度与峰面积比值呈良好的线性关系。
2.3.4 精密度试验
首先，精确量取适量溴甲烷对照品溶液，以内标溶液稀释成每1.00 mL中约含50 ng溴甲烷的溶液，作为精密度试验溶液。其次，精确量取2.00 mL置于顶空瓶中，按照设定的色谱条件连续测定6次，测得溴甲烷相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为3.94%，溴乙烷RSD为8.98%，峰面积比值RSD为6.03%，仪器精密度良好（n=6）。
2.3.5 重复性试验
取溴地斯的明约100 mg，精确称定，置于顶空瓶中，精确加入内标液2.00 mL，振摇使其溶解，密封，作为供试品溶液；
另按精密度试验方法配制对照品溶液；
顶空平衡温度为50 ℃，平衡时间为20 min，分别取对照品溶液和供试品溶液顶空进样测定，记录色谱图，连续测定6次，按内标法计算溴甲烷残留量。结果显示，6次测定溴甲烷的检出量RSD为5.86%，重复性良好。
2.3.6 回收率试验
精确称取供试品约250 mg置于5.00 mL容量瓶中，用内标液稀释“线性试验”项下的线性储备液0.25、0.50、 0.75 mL各3份，并定容，振摇使其溶解，作为低、中、高3种质量浓度的溶液（分别为限量质量浓度的50.00%、100.00%、150.00%）。另按上述方法制备对照品溶液，各精确量取2.00 mL，置于顶空瓶中，密封，50 ℃预热 20 min，顶空进样测定，计算回收率。测定结果如表1所示。该结果表明，9份样品溴甲烷平均回收率为98.53%，RSD为1.26%，回收率符合要求。
2.3.7 中间精密度试验
按照重复性测定方法，由另一试验人员另取6份供试品溶液进行测定，合并计算12次测定结果。结果表明，12次测定溴甲烷的检出量RSD为5.30%，中间精密度良好。
2.3.8 耐用性试验
在柱流速和温度发生微小变化时，分别精确量取对照品溶液和供试品溶液各2.00 mL，置于顶空瓶中，密封，50 ℃预热20 min，顶空进样，记录色谱图，观察色谱条件发生的微小变化，溴甲烷的检出量在0.12%～0.15%，影响不大，故耐用性良好。
2.3.9 样品测定
取3批溴地斯的明（220706/220712/220713）配成供试品溶液，按规定的色谱条件进样，3批样品中溴甲烷的质量分数分别为0.000 005%、0.000 004%、0.000 007%，表明3批样品中溴甲烷的残留量均符合标准。
3 讨论
3.1 监测离子的选择
精确称取适量溴甲烷对照品溶液及溴乙烷，顶空进样并分析。采用SCAN全扫描模式在50～150 amu质量扫描范围内对溴甲烷、溴乙烷进行测定，所得质谱如图6、图7所示，定性分析确定溴甲烷的定量离子（m/z）为94，溴乙烷的定量离子（m/z）为108。
3.2 各参数条件的筛选
毛细管柱的选择很重要，不同毛细管柱（VF-624ms、VF-WAXms）对溴甲烷的影响很大，会出现响应值低和空白溶剂存在干扰的情况。HP-1ms毛细管柱检测出的峰形较好，空白溶剂不干扰检测，专属性强，故采用此毛细管柱。
在其他色谱条件的摸索过程中，首先采用的是不分流进样，发现色谱峰的响应值不符合要求，峰形不完整。若采用分流进样，当分流比为15∶1时，溴甲烷和溴乙烷能分离出来，且响应值正常，故采用分流进样。
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